Un método para medir el colesterol en lipoproteínas remanentes en el que se utiliza una colesterol esterasa en un método para medir el colesterol en las lipoproteínas mediante la medición del peróxido de hidrógeno o una coenzima reducida obtenidos al permitir que la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa o una colesterol deshidrogenasa actúe sobre una muestra de ensayo que contiene una lipoproteína caracterizado porque la colesterol esterasa no sólo tiene actividad esterasa,

sino también actividad lipoproteína lipasa con lo que la razón de actividad de una lipoproteína lipasa con respecto a una colesterol esterasa (actividad lipoproteína lipasa/actividad colesterol esterasa) es de 12 a 7000

Un método para medir el colesterol en lipoproteínas remanentes.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para medir el colesterol en lipoproteínas remanentes, y también para la medición de un reactivo para el colesterol en lipoproteínas remanentes.

Técnica anterior

Con la tendencia reciente hacia una sociedad que envejece, la morbilidad de las enfermedades de adultos está aumentando rápidamente. En particular, la arteriosclerosis es bien conocida como uno de los principales factores causantes de enfermedades del sistema circulatorio, tales como las enfermedades del corazón y las enfermedades cerebrovasculares (incluyendo el infarto cerebral).

La acumulación de colesterol en los vasos sanguíneos desempeña un papel esencial en el crecimiento de la arteriosclerosis, y se asocia a varias lipoproteínas en la sangre. Las lipoproteínas, incluyen el colesterol, los ésteres de colesterol, la grasa neutra, los fosfolípidos y las apoproteínas como componentes. De estas lipoproteínas, el colesterol en las lipoproteínas de alta densidad (HDL) se conoce como un factor de riesgo negativo para la arteriosclerosis, mientras que el colesterol en lipoproteínas de baja densidad (LDL) es conocido como un factor de riesgo positivo para la arteriosclerosis. Estos colesteroles se observan frecuentemente en el campo del diagnóstico clínico.

En los últimos años, sin embargo, se ha informado de que el colesterol en una lipoproteína inducida por un metabolismo lipídico tal como una lipoproteína remanente, más que el colesterol LDL, es un indicador más estrechamente relacionado como factor de riesgo de la arteriosclerosis. Desde el punto de vista de estos problemas, es cada vez más necesario desarrollar un método tecnológico para la medición de colesteroles en lipoproteínas de muestras biológicas con mayor facilidad y eficiencia.

Entre los métodos convencionales existentes para medir enzimáticamente el colesterol en lipoproteínas remanentes, hay informes que describen un método caracterizado por una creciente selectividad de medición mediante el uso de un gel sobre el cual se inmoviliza un anticuerpo para una apoproteína como componente de la lipoproteína o utilizando una enzima que degrada fosfolípidos, un tensioactivo, o similares, lo que permite a la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa o la colesterol deshidrogenasa actuar para que el éster de colesterol se convierta en colesterol, y luego medir el peróxido de hidrógeno o la coenzima reducida producidos (véanse los Documentos de Patente 1 y 2 y el Documento No de Patente 1).

Incluso esos métodos, sin embargo, tienen ventajas y desventajas en términos de selectividad de las lipoproteínas remanentes, facilidad de operación, período de tiempo de medición, y similares, y por lo tanto no son necesariamente suficientes.

Documento de Patente 1: Solicitud de Patente Japonesa Abierta a la Inspección Pública (JP-A) Núm. 2001-231597.

Documento de Patente 2: Patente Japonesa Núm. 2949354

Documento No de Patente 1: Domyakukoka (arteriosclerosis), 25 (9, 10), 371 (1998).

Descripción de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para la medición con más facilidad y precisión del colesterol en una proteína remanente y proporcionar un reactivo para su uso en la realización de ese método.

A la luz de las circunstancias, los autores de la presente invención se han centrado en el hecho de que muchas colesterol esterasas tienen no sólo actividad esterasa sino también un poco de actividad lipoproteína lipasa e investigaron varias afecciones para la medición del colesterol en lipoproteínas. Como resultado, se ha encontrado que si una colesterol esterasa en que la tasa de actividad de la lipoproteína lipasa es superior a la de la colesterol esterasa se selecciona y se utiliza con la colesterol oxidasa o la colesterol deshidrogenasa para medir el colesterol de las lipoproteínas, la selectividad hacia las lipoproteínas remanentes será alta y el colesterol de las lipoproteínas remanentes puede ser medido de forma selectiva a partir de muestras biológicas que contienen lipoproteínas tales como las lipoproteínas de alta densidad (HDL), las lipoproteínas de baja densidad (LDL), los quilomicrones (CM), las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), los CM remanentes, las VLDL remanentes y las lipoproteínas de densidad intermedia (IDL) remanentes.

Por lo tanto, la presente invención está dirigida a un método para medir el colesterol en lipoproteínas remanentes, caracterizado porque se utiliza una colesterol esterasa, en la que la razón de actividad de una lipoproteína lipasa con respecto a una colesterol esterasa (actividad lipoproteína lipasa/actividad colesterol esterasa) es de 12 a 7000, en un método para medir el colesterol en la lipoproteína midiendo el peróxido de hidrógeno o una coenzima reducida obtenida al permitir que la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa o una colesterol deshidrogenasa actúe en una muestra de ensayo que contenga una lipoproteína.

La presente invención también se refiere a un reactivo de medición para el colesterol en lipoproteínas remanentes, incluyendo: una colesterol esterasa en la que la razón de actividad de una lipoproteína lipasa con respecto a una colesterol esterasa (actividad lipoproteína lipasa/actividad colesterol esterasa) es de 12 a 7000; y una colesterol oxidasa o una colesterol deshidrogenasa.

Efectos de la invención

Cuando se utilizan el método de medición y el reactivo de medición de acuerdo con la presente invención, el colesterol de las lipoproteínas remanentes se puede medir muy fácilmente con alta sensibilidad en poco tiempo.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un gráfico que muestra la especificidad de reacción con respecto a LDL en un caso en el que se utiliza una enzima LP;

La Fig. 2 es un gráfico que muestra la especificidad de reacción con respecto HDL en un caso en el que se utiliza una enzima LP;

La Fig. 3 es un gráfico que muestra la especificidad de reacción con respecto a VLDL no unida y VLDL unida en el método de la presente invención;

La Fig. 4 es un gráfico que muestra la reactividad con respecto a VLDL no unida y VLDL unida en un caso en el que se añaden anticuerpos, y

La Fig. 5 es un gráfico que muestra una correlación entre el método de medición de la presente invención y un método de medición existente (RLP-II) cuando se miden las lipoproteínas remanentes en sangre.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

De acuerdo con la presente invención, el método para medir el colesterol en las lipoproteínas remanentes se realiza de la siguiente manera: se miden el peróxido de hidrógeno o una coenzima reducida obtenidos al permitir que la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa o una colesterol deshidrogenasa actúen y se utiliza una colesterol esterasa, en la que la razón de actividad de la lipoproteína lipasa (LPL) con respecto a la colesterol esterasa (CE) (actividad lipoproteína lipasa/actividad colesterol esterasa) es de 12 a 7000.

La colesterol esterasa es una enzima que puede hidrolizar los ésteres de colesterol de las lipoproteínas para producir colesterol. Se sabe que en muchos casos, esta enzima tiene no sólo actividad esterasa sino también una pequeña actividad lipoproteína lipasa, es decir, actividad lipasa que hidroliza la grasa neutra. En la presente invención, es necesario utilizar una colesterol esterasa que tenga una actividad lipoproteína lipasa más fuerte que la actividad colesterol esterasa y, específicamente, es necesario utilizar una colesterol esterasa en la que la razón de actividad de la lipoproteína lipasa con respecto a la colesterol esterasa (actividad lipoproteína lipasa/actividad colesterol esterasa) sea de 12 a 7000, de modo que la enzima pueda actuar selectivamente sobre las lipoproteínas remanentes para permitir la hidrólisis selectiva de los ésteres de colesterol en la proteína. Por tanto, sólo se puede medir selectivamente el colesterol deseado de las lipoproteínas remanentes.

En la presente memoria, la actividad lipoproteína lipasa se refiere a una unidad de actividad que se calcula de acuerdo a un método de análisis de la actividad lipoproteína lipasa utilizando una emulsión de aceite de oliva (Horiuchi Y. et al., J Biochem 1976; 80:367-370),...

1. Un método para medir el colesterol en lipoproteínas remanentes en el que se utiliza una colesterol esterasa en un método para medir el colesterol en las lipoproteínas mediante la medición del peróxido de hidrógeno o una coenzima reducida obtenidos al permitir que la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa o una colesterol deshidrogenasa actúe sobre una muestra de ensayo que contiene una lipoproteína caracterizado porque la colesterol esterasa no sólo tiene actividad esterasa, sino también actividad lipoproteína lipasa con lo que la razón de actividad de una lipoproteína lipasa con respecto a una colesterol esterasa (actividad lipoproteína lipasa/actividad colesterol esterasa) es de 12 a 7000.

2. El método de acuerdo con la Reivindicación 1, caracterizado porque la razón de actividad de la lipoproteína lipasa con respecto a la colesterol esterasa (actividad de la lipoproteína lipasa/actividad colesterol esterasa) es de 28 a 800.

3. El método de acuerdo con la Reivindicación 1, donde la colesterol esterasa se selecciona entre LP, LPBP, CEN, CE, y COE 311.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente el pretratamiento de la muestra de ensayo con un anticuerpo anti-apoB-100 y/o un anticuerpos anti-apoA-I.

5. Un reactivo de medición para el colesterol en las lipoproteínas remanentes, que comprende:

6. El reactivo de medición de acuerdo con la Reivindicación 5, donde la razón de actividad de la lipoproteína lipasa con respecto a la colesterol esterasa (actividad lipoproteína lipasa/actividad colesterol esterasa) es 28 a 800.

7. El reactivo de acuerdo con la Reivindicación 5, donde la colesterol esterasa se selecciona entre LP, LPBP, el CEN, CE, y COE 311.

8. Un reactivo de medición para el colesterol en lipoproteínas remanentes, que comprende: