TRANSCRIPCION Y TRADUCCION IN VITRO LIBRE DE CELULAS DE PROTEINAS DE MEMBRANA EN CAPAS LIPIDICAS PLANAS UNIDAS.

Un procedimiento para la preparación de proteínas de membrana incorporadas en una membrana,

que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una membrana, en la que la membrana es una membrana unida a una superficie,

(ii) aplicar a la membrana un sistema de expresión libre de células y un ácido nucleico que codifica las proteínas de membrana, y

(iii) expresar las proteínas de membrana, que se integran en la membrana

Transcripción y traducción in vitro libre de células de proteínas de membrana en capas lipídicas planas unidas.

La presente invención se refiere a membranas, en particular a membranas sintéticas, que tienen proteínas de membrana incorporadas en ellas, y, en particular, a la transcripción y traducción in vitro libre de células de proteínas de membrana en membranas, por ejemplo en capas lipídicas planas unidas. En particular, la presente invención proporciona un nuevo método para la preparación de tales membranas. Las membranas se pueden usar, por ejemplo, para la investigación de interacciones de receptor de membrana/ligando.

Una investigación detallada de la interacción del receptor de membrana/ligando es un requisito previo para comprender las rutas biológicas complejas que implican a las membranas celulares. Para llevar a cabo tales investigaciones, se requieren sistemas de ensayo in vitro eficaces y reproducibles para caracterizar la interacción de unión específica del receptor/ligando aisladamente de otras interacciones, en las que el receptor puede estar implicado en entornos naturales.

Por lo tanto, se han desarrollado sistemas modelo para membranas biológicas tales como liposomas, membranas lipídicas negras (BLM) planas, así como membranas soportadas en sólidos, tales como bicapas lipídicas soportadas en sólidos y bicapas lipídicas unidas. Las membranas lipídicas unidas (tBLM) son películas lipídicas soportadas en sólidos con grupos espaciadores hidrófilos tales como grupos peptídicos, polietilenglicólicos o de azúcar, unidos covalentemente a un soporte. Para incorporar la proteína de membrana en tales sistemas de membrana modelo, hasta ahora ha sido necesario aislar las proteínas de membrana y reconstituirlas en el sistema de membrana. De este modo, por ejemplo, la formación de una monocapa de fosfolípido sobre un soporte sólido y el sometimiento subsiguiente de esta monocapa a vesículas lipídicas que contienen el receptor de acetilcolina (AChR) conduce a la incorporación del receptor de acetilcolina en una membrana bilipídica, en la que la segunda capa se forma a partir de lípidos contenidos en la vesícula lipídica (E. K. Schmidt et al., Biosensors and Bioelectronics 13 (1998) 585-591). R. Naumann et al. (Biosensors and Bioelectronics 14 (1999) 651-662) describe la incorporación de citocromo c oxidasa en forma funcionalmente activa en una membrana lipídica unida a péptidos. Los liposomas que comprenden fosfatidilcolina se extienden sobre una monocapa lipídica unida a tiopéptido para formar una membrana de bicapa lipídica unida a péptido. Esta membrana se incuba entonces con citocromo c oxidasa aislada.

Un enfoque similar se dio a conocer para la incorporación de integrinas en membranas lipídicas planas artificiales (E. K. Sinner, Analytical Biochemistry 333 (2004) 216-224). En este enfoque, las integrinas se incorporaron en una capa peptídica funcionalizada con lípidos mediante extensión vesicular. También con este enfoque se tuvo que preparar en primer lugar vesículas que contienen proteína de membrana, requiriendo la preparación y el aislamiento de la proteína de membrana.

Un problema en el caso de los métodos de fabricación usados hasta ahora fue que las proteínas de membrana tenían que ser aisladas primero. A menudo, la actividad nativa de las proteínas se perdía por ello. Además, la incorporación en las membranas, por ejemplo en el caso de extensión vesicular, a menudo se efectuaba de forma aleatoria, sin embargo, no dirigida. Esto condujo a sistemas de ensayo no óptimos, en los que la interacción y orientación de las proteínas con y en la membrana, así como su efecto sobre las interacciones con ligandos, no se pudieron investigar.

Por lo tanto, un objeto de la invención fue proporcionar un método mejorado para la preparación de membranas que tienen proteínas de membrana incorporadas en ellas, especialmente un método en el que las proteínas de membrana no tienen que ser aisladas en primer lugar.

Según la invención, este objeto se logra mediante un procedimiento para la preparación de proteínas de membrana incorporadas en una membrana, que comprende las etapas de:

El método de la invención permite incorporar proteínas de membrana en forma funcional nativa en membranas, en particular en membranas sintéticas, sin que las proteínas de membrana se tengan que aislar en primer lugar. Además, se encontró sorprendentemente que, cuando se lleva a cabo el método de la invención, las proteínas expresadas con el sistema de expresión libre de células se incorporan en las membranas en forma dirigida. Según la invención, de este modo, se pueden obtener proteínas activas funcionales en membranas sin necesitar el aislamiento previo. Además, las membranas producidas según la invención tienen una estabilidad elevada, puesto que debido al uso de sistemas de expresión libres de células, por ejemplo, no se encuentran en el sistema proteasas que degradan la proteína.

Se supone que debido a la expresión de las proteínas de membrana con un sistema de expresión libre de células en presencia de una membrana, esta última actúa como un cuasisustituto del retículo endoplasmático. Los sistemas de expresión libres de células se han usado para expresar proteínas solubles en sistemas acuosos, con lo cual en muchos casos se obtienen proteínas no nativamente activas sino proteínas desnaturalizadas, por ejemplo en forma de cuerpos de inclusión. Sorprendentemente, se ha encontrado que mediante la expresión de proteínas en tal sistema de expresión libre de células en presencia de una membrana, preferiblemente una membrana sintética, las proteínas se incorporan en la membrana y, además, están presentes en ella en forma funcional. La incorporación en membranas sintéticas es incluso más sorprendente, puesto que los mecanismos de incorporación para proteínas de membrana que posiblemente todavía están presentes en membranas que aparecen de forma natural o en membranas de origen natural no pueden estar presentes en membranas sintéticas. Por ejemplo, las preparaciones microsómicas que contienen membranas derivadas de fuentes naturales pueden tener mecanismos de incorporación para proteínas de membrana. Sorprendentemente, ahora se ha encontrado por los inventores, sin embargo, que la incorporación funcional de proteínas de membrana también se puede lograr de forma excelente con membranas sintéticas que ya no tienen tales mecanismos.

La membrana empleada es una membrana unida a superficie. También se prefiere usar una membrana plana. Se prefieren particularmente las membranas unidas.

Según una realización particularmente preferida de la invención, en primer lugar se proporciona una membrana sintética. La membrana sintética es preferiblemente una membrana plana y/o tiene una arquitectura de material compuesto vesicular. Especialmente de forma preferible, es una membrana unida aplicada sobre un soporte.

La unión de las membranas se puede efectuar, por ejemplo, vía anclajes peptídicos, anclajes de PEG, anclajes de azúcares, anclajes de silano, anclajes de silano/tiol o anclajes poliméricos, preferiblemente vía anclajes peptídicos. La ligación o unión de la membrana a la superficie se logra preferiblemente usando moléculas espaciadoras hidrófilas.

Las superficies soporte adecuadas, por ejemplo, son un metal u óxido metálico, especialmente superficies de oro o de sílice. En el caso de superficies de oro, la membrana se une a la superficie de oro preferiblemente mediante una interacción Au-S. Las superficies pueden ser dieléctricas o no dieléctricas. En una realización, se usan superficies semiconductoras.

En una realización particularmente preferida, como moléculas espaciadoras hidrófilas para unir membranas lipídicas se usan péptidos. Las moléculas espaciadoras peptídicas adecuadas tienen preferiblemente una longitud de 3-100, preferiblemente 4-30, en particular 5-25, e incluso más preferiblemente 15-20 aminoácidos. Además, las secuencias escogidas tienen un resto de cisteína en un extremo. Cuando se usa una superficie de oro, se puede obtener una capa peptídica monomolecular mediante autoensamblaje...

1. Un procedimiento para la preparación de proteínas de membrana incorporadas en una membrana, que comprende las etapas de:

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la membrana es una membrana sintética.

3. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana es una membrana unida.

4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana se liga o se une a una superficie dieléctrica o a una superficie no dieléctrica.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana se liga o se une a una superficie que consiste en un metal u óxido metálico.

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana comprende componentes de membrana natural, lípidos sintéticamente producidos o polímeros anfifílicos.

7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana es una membrana lipídica de dos capas.

8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína de membrana es una proteína de TM, una proteína asociada a una membrana, o una proteína de recubrimiento de una membrana.

9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las proteínas de membrana se acoplan con un marcador, preferiblemente con un marcador seleccionado de epítopos tales como VSV, marcador de His, marcador de Strep, marcador de Flag, marcador de inteína o marcador de GST, o de una pareja de un par de unión de alta afinidad tal como biotina o avidina, o de una etiqueta tal como una etiqueta fluorescente, una etiqueta enzimática, una etiqueta de RMN o una etiqueta isotópica.

10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las proteínas de membrana están libres de marcadores.

11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sistema de expresión libre de células es un sistema de expresión libre de células eucariotas tal como el sistema TNT® basado en reticulocitos de conejo, un sistema de expresión libre de células procariotas, o un sistema de expresión libre de células arcaicas.