TRANSCRIPCION Y TRADUCCION IN VITRO LIBRE DE CELULAS DE PROTEINAS DE MEMBRANA EN CAPAS LIPIDICAS PLANAS UNIDAS.

Un procedimiento para la preparación de proteínas de membrana incorporadas en una membrana,

que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una membrana, en la que la membrana es una membrana unida a una superficie,

(ii) aplicar a la membrana un sistema de expresión libre de células y un ácido nucleico que codifica las proteínas de membrana, y

(iii) expresar las proteínas de membrana, que se integran en la membrana

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2006/008318.

Solicitante: MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FORDERUNG DER WISSENSCHAFTEN E.V.
SINNER, EVA-KATHRIN
.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: HOFGARTENSTRASSE 8,80539 MUNCHEN.

Inventor/es: SINNER,EVA-KATHRIN, WILTSCHI,BIRGIT, LEMKER,EVA, ROBELEK,RUDOLF.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 24 de Febrero de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K1/04A
  • C07K17/14 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 17/00 Péptidos fijados sobre un soporte o inmovilizados; Su preparación. › Péptidos inmovilizados sobre, o en, un soporte inorgánico.
  • C12P21/02 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.

Clasificación PCT:

  • C07K1/04 C07K […] › C07K 1/00 Procedimientos generales de preparación de péptidos. › sobre soportes.
  • C12P21/02 C12P 21/00 […] › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
TRANSCRIPCION Y TRADUCCION IN VITRO LIBRE DE CELULAS DE PROTEINAS DE MEMBRANA EN CAPAS LIPIDICAS PLANAS UNIDAS.

Fragmento de la descripción:

Transcripción y traducción in vitro libre de células de proteínas de membrana en capas lipídicas planas unidas.

La presente invención se refiere a membranas, en particular a membranas sintéticas, que tienen proteínas de membrana incorporadas en ellas, y, en particular, a la transcripción y traducción in vitro libre de células de proteínas de membrana en membranas, por ejemplo en capas lipídicas planas unidas. En particular, la presente invención proporciona un nuevo método para la preparación de tales membranas. Las membranas se pueden usar, por ejemplo, para la investigación de interacciones de receptor de membrana/ligando.

Una investigación detallada de la interacción del receptor de membrana/ligando es un requisito previo para comprender las rutas biológicas complejas que implican a las membranas celulares. Para llevar a cabo tales investigaciones, se requieren sistemas de ensayo in vitro eficaces y reproducibles para caracterizar la interacción de unión específica del receptor/ligando aisladamente de otras interacciones, en las que el receptor puede estar implicado en entornos naturales.

Por lo tanto, se han desarrollado sistemas modelo para membranas biológicas tales como liposomas, membranas lipídicas negras (BLM) planas, así como membranas soportadas en sólidos, tales como bicapas lipídicas soportadas en sólidos y bicapas lipídicas unidas. Las membranas lipídicas unidas (tBLM) son películas lipídicas soportadas en sólidos con grupos espaciadores hidrófilos tales como grupos peptídicos, polietilenglicólicos o de azúcar, unidos covalentemente a un soporte. Para incorporar la proteína de membrana en tales sistemas de membrana modelo, hasta ahora ha sido necesario aislar las proteínas de membrana y reconstituirlas en el sistema de membrana. De este modo, por ejemplo, la formación de una monocapa de fosfolípido sobre un soporte sólido y el sometimiento subsiguiente de esta monocapa a vesículas lipídicas que contienen el receptor de acetilcolina (AChR) conduce a la incorporación del receptor de acetilcolina en una membrana bilipídica, en la que la segunda capa se forma a partir de lípidos contenidos en la vesícula lipídica (E. K. Schmidt et al., Biosensors and Bioelectronics 13 (1998) 585-591). R. Naumann et al. (Biosensors and Bioelectronics 14 (1999) 651-662) describe la incorporación de citocromo c oxidasa en forma funcionalmente activa en una membrana lipídica unida a péptidos. Los liposomas que comprenden fosfatidilcolina se extienden sobre una monocapa lipídica unida a tiopéptido para formar una membrana de bicapa lipídica unida a péptido. Esta membrana se incuba entonces con citocromo c oxidasa aislada.

Un enfoque similar se dio a conocer para la incorporación de integrinas en membranas lipídicas planas artificiales (E. K. Sinner, Analytical Biochemistry 333 (2004) 216-224). En este enfoque, las integrinas se incorporaron en una capa peptídica funcionalizada con lípidos mediante extensión vesicular. También con este enfoque se tuvo que preparar en primer lugar vesículas que contienen proteína de membrana, requiriendo la preparación y el aislamiento de la proteína de membrana.

Un problema en el caso de los métodos de fabricación usados hasta ahora fue que las proteínas de membrana tenían que ser aisladas primero. A menudo, la actividad nativa de las proteínas se perdía por ello. Además, la incorporación en las membranas, por ejemplo en el caso de extensión vesicular, a menudo se efectuaba de forma aleatoria, sin embargo, no dirigida. Esto condujo a sistemas de ensayo no óptimos, en los que la interacción y orientación de las proteínas con y en la membrana, así como su efecto sobre las interacciones con ligandos, no se pudieron investigar.

Por lo tanto, un objeto de la invención fue proporcionar un método mejorado para la preparación de membranas que tienen proteínas de membrana incorporadas en ellas, especialmente un método en el que las proteínas de membrana no tienen que ser aisladas en primer lugar.

Según la invención, este objeto se logra mediante un procedimiento para la preparación de proteínas de membrana incorporadas en una membrana, que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una membrana, en la que la membrana es una membrana unida a una superficie,
(ii) aplicar a la membrana un sistema de expresión libre de células y un ácido nucleico que codifica las proteínas de membrana, y
(iii) expresar las proteínas de membrana, que se integran en la membrana.

El método de la invención permite incorporar proteínas de membrana en forma funcional nativa en membranas, en particular en membranas sintéticas, sin que las proteínas de membrana se tengan que aislar en primer lugar. Además, se encontró sorprendentemente que, cuando se lleva a cabo el método de la invención, las proteínas expresadas con el sistema de expresión libre de células se incorporan en las membranas en forma dirigida. Según la invención, de este modo, se pueden obtener proteínas activas funcionales en membranas sin necesitar el aislamiento previo. Además, las membranas producidas según la invención tienen una estabilidad elevada, puesto que debido al uso de sistemas de expresión libres de células, por ejemplo, no se encuentran en el sistema proteasas que degradan la proteína.

Se supone que debido a la expresión de las proteínas de membrana con un sistema de expresión libre de células en presencia de una membrana, esta última actúa como un cuasisustituto del retículo endoplasmático. Los sistemas de expresión libres de células se han usado para expresar proteínas solubles en sistemas acuosos, con lo cual en muchos casos se obtienen proteínas no nativamente activas sino proteínas desnaturalizadas, por ejemplo en forma de cuerpos de inclusión. Sorprendentemente, se ha encontrado que mediante la expresión de proteínas en tal sistema de expresión libre de células en presencia de una membrana, preferiblemente una membrana sintética, las proteínas se incorporan en la membrana y, además, están presentes en ella en forma funcional. La incorporación en membranas sintéticas es incluso más sorprendente, puesto que los mecanismos de incorporación para proteínas de membrana que posiblemente todavía están presentes en membranas que aparecen de forma natural o en membranas de origen natural no pueden estar presentes en membranas sintéticas. Por ejemplo, las preparaciones microsómicas que contienen membranas derivadas de fuentes naturales pueden tener mecanismos de incorporación para proteínas de membrana. Sorprendentemente, ahora se ha encontrado por los inventores, sin embargo, que la incorporación funcional de proteínas de membrana también se puede lograr de forma excelente con membranas sintéticas que ya no tienen tales mecanismos.

La membrana empleada es una membrana unida a superficie. También se prefiere usar una membrana plana. Se prefieren particularmente las membranas unidas.

Según una realización particularmente preferida de la invención, en primer lugar se proporciona una membrana sintética. La membrana sintética es preferiblemente una membrana plana y/o tiene una arquitectura de material compuesto vesicular. Especialmente de forma preferible, es una membrana unida aplicada sobre un soporte.

La unión de las membranas se puede efectuar, por ejemplo, vía anclajes peptídicos, anclajes de PEG, anclajes de azúcares, anclajes de silano, anclajes de silano/tiol o anclajes poliméricos, preferiblemente vía anclajes peptídicos. La ligación o unión de la membrana a la superficie se logra preferiblemente usando moléculas espaciadoras hidrófilas.

Las superficies soporte adecuadas, por ejemplo, son un metal u óxido metálico, especialmente superficies de oro o de sílice. En el caso de superficies de oro, la membrana se une a la superficie de oro preferiblemente mediante una interacción Au-S. Las superficies pueden ser dieléctricas o no dieléctricas. En una realización, se usan superficies semiconductoras.

En una realización particularmente preferida, como moléculas espaciadoras hidrófilas para unir membranas lipídicas se usan péptidos. Las moléculas espaciadoras peptídicas adecuadas tienen preferiblemente una longitud de 3-100, preferiblemente 4-30, en particular 5-25, e incluso más preferiblemente 15-20 aminoácidos. Además, las secuencias escogidas tienen un resto de cisteína en un extremo. Cuando se usa una superficie de oro, se puede obtener una capa peptídica monomolecular mediante autoensamblaje...

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para la preparación de proteínas de membrana incorporadas en una membrana, que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una membrana, en la que la membrana es una membrana unida a una superficie,
(ii) aplicar a la membrana un sistema de expresión libre de células y un ácido nucleico que codifica las proteínas de membrana, y
(iii) expresar las proteínas de membrana, que se integran en la membrana.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la membrana es una membrana sintética.

3. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana es una membrana unida.

4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana se liga o se une a una superficie dieléctrica o a una superficie no dieléctrica.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana se liga o se une a una superficie que consiste en un metal u óxido metálico.

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana comprende componentes de membrana natural, lípidos sintéticamente producidos o polímeros anfifílicos.

7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la membrana es una membrana lipídica de dos capas.

8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína de membrana es una proteína de TM, una proteína asociada a una membrana, o una proteína de recubrimiento de una membrana.

9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las proteínas de membrana se acoplan con un marcador, preferiblemente con un marcador seleccionado de epítopos tales como VSV, marcador de His, marcador de Strep, marcador de Flag, marcador de inteína o marcador de GST, o de una pareja de un par de unión de alta afinidad tal como biotina o avidina, o de una etiqueta tal como una etiqueta fluorescente, una etiqueta enzimática, una etiqueta de RMN o una etiqueta isotópica.

10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las proteínas de membrana están libres de marcadores.

11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sistema de expresión libre de células es un sistema de expresión libre de células eucariotas tal como el sistema TNT® basado en reticulocitos de conejo, un sistema de expresión libre de células procariotas, o un sistema de expresión libre de células arcaicas.


 

Patentes similares o relacionadas:

Método para preparar una disolución acuosa que contiene medio de cultivo y agente quelante, del 22 de Julio de 2020, de Kyowa Kirin Co., Ltd: Método para preparar una disolución acuosa que presenta una filtrabilidad de membrana mejorada que comprende un medio de cultivo, en el que el medio de […]

PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE SUBPRODUCTOS A PARTIR DE RESIDUOS DE CAFÉ Y APLICACIONES DE LOS MISMOS, del 13 de Julio de 2020, de UNIVERSIDAD DE GRANADA: Procedimiento de obtención de subproductos a partir de residuos de café y aplicaciones de los mismos. La presente invención consiste en un proceso […]

Biblioteca de péptidos y su uso, del 8 de Julio de 2020, de DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED: Una biblioteca de péptidos que comprende una pluralidad de péptidos diferentes en la que los péptidos comprenden cada uno una secuencia de aminoácidos […]

Métodos para controlar la producción de proteasas, del 1 de Julio de 2020, de ROAL OY: Una célula hospedadora que comprende al menos un gen cromosómico inactivado en donde el gen cromosómico inactivado comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un […]

Señal para el empaquetamiento de vectores del virus de la gripe, del 24 de Junio de 2020, de WISCONSIN ALUMNI RESEARCH FOUNDATION: Un vector del virus de la gripe para la expresión y empaquetamiento de ARNv recombinante, en el que el vector comprende: secuencias correspondientes […]

Lipopéptidos de alta pureza, micelas de lipopéptidos y procesos para preparar los mismos, del 6 de Mayo de 2020, de Cubist Pharmaceuticals LLC: Un método para purificar daptomicina a partir de moléculas o agregados de alto peso molecular, en donde la daptomicina se proporciona en forma micelar, dicho […]

Proceso para la purificación de daptomicina, del 6 de Mayo de 2020, de Cubist Pharmaceuticals LLC: Un método para purificar daptomicina que comprende: a) someter a la daptomicina a condiciones en las que una solución micelar de daptomicina se forma alterando el pH; y […]

Métodos para ajustar los niveles de producción de carotenoides y composiciones en géneros de Rhodosporidium y Rhodotorula, del 15 de Abril de 2020, de TEMASEK LIFE SCIENCES LABORATORY LIMITED: Un método para ajustar el nivel de producción y la composición de carotenoides en un huésped fúngico que comprende: (a) manipular genéticamente […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .