Un procedimiento de rescate de un virus de la gripe recombinante,

comprendiendo el procedimiento:

(i)electroporar células Vero con vectores de polinucleótidos que dirigen la expresión en dichas células Vero de segmentos de ARNv genómicos o antigenómicos, y una nucleoproteína, y una polimerasa dependiente de ARN, de tal manera que se puedan formar complejos de ribonucleoproteínas y se puedan ensamblar partículas víricas en ausencia del virus auxiliar;

(ii)cultivar simultáneamente las células Vero electroporadas con otro tipo de células en condiciones que permiten la replicación vírica; y

(iii)recuperar el virus de la gripe,

en el que la eficacia del rescate es al menos del 90%

Sistema multiplásmido para la producción del virus de la gripe.

Antecedentes de la invención

Los virus de la gripe están compuestos por un núcleo interno de ribonucleoproteína que contiene un genoma de ARN de cadena única segmentada y una envoltura de lipoproteína externa revestida por una proteína de matriz. Cada uno de los virus de la gripe de tipo A y B contiene ocho segmentos de ARN de cadena única con polaridad negativa. El genoma de la gripe de tipo A codifica al menos once polipéptidos. Los segmentos 1-3 codifican tres polipéptidos, compuestos por ARN polimerasa dependiente del ARN vírico. El segmento 1 codifica la proteína PB2 del complejo de la polimerasa. Las proteínas PB1 y PA de la polimerasa restantes están codificadas por el segmento 2 y el segmento 3, respectivamente. Adicionalmente, el segmento 1 de algunas cepas de gripe A codifica una pequeña proteína, PB1-F2, producida a partir de un marco de lectura alternativo dentro de la región de codificación de PB1. El segmento 4 codifica la glicoproteína superficial hemaglutinina (HA) implicada en la unión celular y en la entrada durante la infección. El segmento 5 codifica el polipéptido de la nucleoproteína de la nucleocápsida (NP), el componente estructural principal asociado con el ARN vírico. El segmento 6 codifica la glicoproteína de envoltura neuraminidasa (NA). El segmento 7 codifica dos proteínas de matriz, designadas M1 y M2, que se traducen a partir de ARNm cortados y empalmados diferencialmente. El segmento 8 codifica NS1 y NS2 (NEP), dos proteínas no estructurales, que se traducen a partir de variantes del ARNm cortadas y empalmadas alternativamente.

Los ocho segmentos del genoma de la gripe B codifican 11 proteínas. Los tres genes más largos codifican los componentes de la ARN polimerasa, PB1, PB2 y PA. El segmento 4 codifica la proteína HA. El segmento 5 codifica NP, el segmento 6 codifica la proteína NA y la proteína NB. Ambas proteínas, NB y NA, se traducen a partir de marcos de lectura solapados de un ARNm bicistrónico. El segmento 7 de la gripe B codifica también dos proteínas: M1 y BM2. El segmento más pequeño codifica dos productos; NS1 se traduce a partir de ARN de longitud completa, mientras que NS2 se traduce a partir de una variante de ARNm de corte y empalme.

Se han producido vacunas capaces de producir una respuesta inmune protectora específica de los virus de la gripe durante 50 años. Se pueden clasificar las vacunas como vacunas de virus completo, vacunas de virus dividido, vacunas de antígeno superficial y vacunas de virus atenuado vivo. Aunque las formulaciones apropiadas de cualquiera de estos tipos de vacunas son capaces de producir una respuesta inmune sistémica, las vacunas de virus atenuados vivos son también capaces de estimular inmunidad mucosal local en el tracto respiratorio.

FluMist^TM es una vacuna atenuada viva que protege a niños y adultos de la enfermedad de la gripe (Belshe y col. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus Vaccine in children N Engl J Med 338:1405-12; Nichol y col. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282: 137-44). Las cepas de la vacuna FluMist^TM contienen los segmentos génicos HA y NA derivados de las cepas naturales que circulan actualmente junto con seis segmentos génicos, PB1, PB2, PA, NP, M y NS, procedentes de un virus donante maestro común (MDV). El MDV de las cepas de gripe A de FluMist (MDV-A) se creó mediante un paso en serie de la cepa A/Ann Arbor/6/60 (A/AA/6/60) natural en cultivos primarios de tejido de riñón de pollo a temperaturas sucesivamente más bajas (Maasab (1967) Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C Nature 213: 612-4). MDV-A se replica eficazmente a 25ºC (ca, adaptado al frío), pero su crecimiento se restringe a 38 y 39ºC (ts, sensible a la temperatura). Adicionalmente, este virus no se replica en los pulmones de hurones infectados (att, atenuación). Se cree que el fenotipo ts contribuye a la atenuación de la vacuna en seres humanos restringiendo su replicación en todas las regiones más frías del tracto respiratorio. Se ha demostrado la estabilidad de esta propiedad en modelos animales y estudios clínicos. A diferencia del fenotipo ts de las cepas de gripe creadas mediante mutagénesis química, la propiedad ts de MDV-A no revierte tras el paso a través de aislados de hámster o niños infectados (para una revisión reciente, véase Murphy y Coelingh (2002) Principel underlying the development an use of live attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines Viral Immunol 15: 295-323).

Estudios clínicos en más de 20.000 adultos y niños que implican 12 cepas separadas 6:2 de genomas reordenados han demostrado que estas vacunas son atenuadas, seguras y eficaces (Belshe y col. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus Vaccine in children N Engl J Med 338: 1405-12; Boyce y col. (2000) Safety and immunogenicity of adjuvanted a unadjuvanted subunit influenza vaccines administered intranasally to healthy adults Vaccine 19: 217-26; Edwards y col. (1994) A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease J Infect Dis 169: 68-76; Nichol y col. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282; 137-44). Reassortants carrying the six internal genes of MDV-A and the two HA and NA gene segments of de wt virus (6:2 reassortant) consistently maintain ca, ts and att phenotypes (Maassab y col. (1982) Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets J Infect Dis 146: 780-900).

Hasta la fecha, todas las vacunas de la gripe comercialmente disponibles en los Estados Unidos se han propagado en huevos de gallina con embrión. Aunque el virus de la gripe crece bien en los huevos de gallina, la producción de la vacuna es dependiente de la disponibilidad de huevos. Se deben organizar los suministros de huevos, y seleccionarse las cepas para la producción de vacunas con meses de adelanto a la próxima gripe estacional, lo que limita la flexibilidad de esta solución, y a menudo da como resultado retrasos y reducciones en la producción y distribución. Desafortunadamente, algunas cepas de la vacuna de la gripe, tales como la cepa prototipo A/Fujian/411/02 que circuló durante la estación 2003-04 no se replican bien en huevos con embrión de pollo, y han de aislarse mediante cultivo celular en un procedimiento costoso y que requiere tiempo. La presente invención proporciona además una nueva tecnología que aumenta la capacidad de las cepas de la vacuna de replicarse en huevos con embriones de pollo. Además, la presente invención permite la producción más eficaz y económica de vacunas de la gripe.

Se han desarrollado en los últimos años sistemas para producir virus de la gripe en cultivo celular (Véanse, por ejemplo, Furminger. Vaccine Production, en Nicholson y col. (eds) textbook of influenza pp. 324-332; Merten y col. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for Vaccine preparation, en Cohen y Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151). Normalmente, estos procedimientos implican la infección de células huéspedes inmortalizadas adecuadas con una cepa seleccionada de virus. Aunque eliminan muchas de las dificultades relacionadas con la producción de vacunas en huevos de gallina, no todas las cepas patógenas de la gripe crecen bien y se pueden producir de acuerdo a los procedimientos establecidos de cultivo de tejidos. Adicionalmente, muchas cepas con características deseables, por ejemplo, atenuación, sensibilidad a la temperatura y adaptación al frío, adecuadas para la producción de vacunas atenuadas vivas, no han crecido satisfactoriamente en cultivos de tejidos usando los procedimientos establecidos.

La producción de virus de la gripe a partir de ADN de genoma reordenado podría aumentar significativamente la flexibilidad y la utilidad de los procedimientos de cultivo de tejidos en la producción de vacunas de la gripe. Recientemente, se ha informado de sistemas para producir virus de la gripe A a partir de plásmidos de genoma reordenados que incorporan ADNc que codifica el genoma vírico (Véanse, por ejemplo, Neumann y col. (1999) Generation of influenza A virus entirely from cloned cDNAs. Proc Natl Acad Sci USA 96: 9345-9350; Fodor y col. (1999) Rescue of influenza A virus from recombinant DNA. J. Virol 73: 9679-9682; Hoffmann y col. (2000) A DNA transfection system...

1. Un procedimiento de rescate de un virus de la gripe recombinante, comprendiendo el procedimiento:

en el que la eficacia del rescate es al menos del 90%.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células Vero son células Vero SF.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichos otros tipos de células son células CEK.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el virus de la gripe es un virus de la gripe A.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el virus de la gripe es un virus de la gripe B.

6. el procedimiento de la reivindicación 1, en el que el virus de la gripe es un virus adaptado al frío.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el virus de la gripe es un virus atenuado.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que los vectores son un conjunto de plásmidos y en el que el número de plásmidos diferentes en el conjunto de plásmidos es ocho.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que los vectores son un conjunto de plásmidos y en el que el número de plásmidos diferentes en el conjunto de plásmidos es doce.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que los vectores dirigen la expresión de al menos un segmento de ARNv derivado de A/PR/8/34.

11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que los vectores dirigen la expresión de al menos un segmento de ARNv derivado de MDV-A.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que los vectores dirigen la expresión de al menos un segmento de ARNv derivado de MDV-B.

13. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el dichos otros tipos de células son células MDCK.

14. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el MDV-A es A/Ann Arbor/6/60.

15. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el MDV-B es B/Ann Arbor/1/66.