La presente invención de refiere a un método y un aparato para conseguir y mantener múltipées cultivos biológicos,

con unas características ambientales similares a las de los biorreactores de mayor tamaño ( a partir de 1L) y con un grado de automatización de las medidas paredico al que se obtiene actualmente con las microplacas (1-2 mL). Las características ambientales incluyen como mínimo, medida y control de temperatura, agitación y aireación, medida y control de pH y oxígeno disuelto, y medida de la biomasa

Sistema modular de múltiples minibiorreactores automatizados para screening multifuncional (HTS) en biotecnología.

La presente invención se refiere a un método y un aparato para conseguir y mantener múltiples cultivos biológicos, con unas características ambientales similares a las de los biorreactores de mayor tamaño (a partir de 1 l) y con un grado de automatización de las medidas parecido al que se obtiene actualmente con las microplacas (1-2 ml). Las características ambientales pueden incluir medida y control de temperatura, agitación y aireación, medida y control de pH y oxígeno disuelto, y medida de la biomasa.

Estado de la técnica

La aplicación de la tecnología basada en la utilización de técnicas de genómica y proteómica y de química combinatoria está favoreciendo el desarrollo de organismos nuevos o mejorados, nuevas substancias y nuevos procesos. Las áreas de aplicación de estas técnicas son tan amplias como la biomedicina, biotecnología, industria alimentaria y medio ambiente, y sin duda irán en aumento en un futuro próximo, dado el potencial de esta tecnología. No debe tampoco olvidarse que todavía están por descubrir muchas capacidades en los organismos existentes. En este sentido, se deberá hacer frente a la capacidad de explorar, en tiempos razonables y con medios altamente tecnificados, automatizados y estandarizados, tanto el potencial de las diferentes células y enzimas naturales o modificados, como los efectos terapéuticos y/o tóxicos de las diferentes moléculas desarrolladas con las mencionadas técnicas. La denominación que han adquirido los sistemas que permiten esta exploración es la de High Throughput Screening (HTS).

El HTS en Biotecnología puede abordarse a distintos niveles y los sistemas existentes se adecuan a cada uno de ellos atendiendo a las necesidades específicas requeridas por el usuario final. Así, a nivel molecular, el interés se centra en permitir la realización de múltiples ensayos, normalmente de tipo enzimático, donde se suelen seguir múltiples actividades o metabolitos, en distintas fases del desarrollo de productos en Biotecnología, y más en particular en el área de las aplicaciones terapéuticas. En cambio, a nivel celular, las acciones se centran en la determinación mediante métodos manuales y visuales del efecto de los productos en fases clínicas o a ensayos sobre los efectos de diversos compuestos sobre el crecimiento y/o actividad celular.

Las tecnologías que se utilizan actualmente en los procesos de identificación y desarrollo de nuevas sustancias y procesos son por un lado elementos de cultivo de volumen pequeño (1-10 mL) que no permiten el control in situ de las variables críticas del proceso, y cuya monitorización mediante técnicas convencionales es cuando menos costosa en lo referente al tiempo requerido. Además dado el pequeño volumen de reacción, el número de muestras que se pueden extraer es reducido. Por tanto la implementación de sistemas de medida in situ y en línea supondría un claro avance en este campo.

Por otro lado, el uso de sistemas de medida en linea está restringido a biorreactores de escala de laboratorio (2-5 litros) y superiores. Sin embargo su elevado coste de compra, su coste de operación (ciertamente elevado si nos referimos en cultivos de células animales) y la necesidad de mano de obra ciertamente especializada dificulta el uso de baterías de biorreactores para el estudio de diferentes condiciones de cultivo/reacción para cada potencial producto de interés. Existe pues, un potencial vacío tecnológico que combine las capacidades de medida y control de un biorreactor con la escalabilidad de los pequeños sistemas de reacción/cultivo. Es este vacío el que la presente patente pretende cubrir.

En las etapas iniciales del desarrollo de nuevas substancias con actividad biológica o procesos biotecnológicos la determinación de parámetros como por ejemplo la concentración de oxígeno disuelto, el pH, la temperatura o la fuerza iónica del medio es de especial interés. Sin un claro conocimiento de sus valores y márgenes de variación durante los ensayos puede resultar poco menos que imposible reproducir las condiciones ambientales en las que éste se generó, haciendo poco menos que inviable el pase a posteriores etapas de desarrollo. El atractivo del concepto en que se basa este equipo es que en el HTS se podrán determinar las condiciones del proceso final.

Un estudio de los equipos existentes en el mercado revela que el producto con una mayor similitud con el que se presenta en lo que se refiere a su diseño y volumen, es un equipo que consta de diferentes viales cuyo potencial campo de aplicación consiste en la síntesis de compuestos según esquemas de química combinatoria. Sin embargo, su diseño no está orientado al uso de dichos viales como biorreactores.

Además del campo químico, en el campo médico también existen productos con ciertas similitudes al que se presenta, aunque en este caso las similitudes no sean tan de diseño como funcionales. Así, en el ámbito hospitalario hay equipos que se basan en placas de 1 o 6 pozos de cultivo (elementos típicos de laboratorio de cultivo) que se utilizan para mantener cultivos de determinadas muestras de tejido, lo cual se hace mediante la perfusión continua de medio a través de los pozos de cultivo dónde se encuentran los tejidos. Dichas placas precisan, sin embargo, de un equipamiento voluminoso (incubador) para mantener las condiciones de temperatura, humedad y composición atmosférica, y carecen de un sistema de monitorización en línea de las condiciones del cultivo.

WO2002/14539, en la que se basa el preámbulo de la reivindicación 1, describe una biorecator para realizar varios cultivos simultáneos en microbioreactores, con sensores ópticos para monitorizar las propiedades de los cultivos.

Descripción de la invención

De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención se refiere a un dispositivo como se reivindica en la reivindicación 1.

En una realización preferida, cada placa comprende además un agitador central del baño de termostatado.

Preferiblemente, la placa comprende una pluralidad de minibiorreactores individuales en disposición poligonal, con una zona central que facilita el termostatado común de dichos minibiorreactores.

La disposición geométrica centrosimétrica de los pocillos dentro de la placa asegura, por diseño, que el control global de temperatura puede realizarse de forma centralizada, asegurando la homogeneidad térmica de todos los minibiorreactores La forma poligonal permite el acoplamiento lateral de múltiples placas con el fin de formar macroconjuntos de minibiorreactores que serían acondicionados por un equipo común, con variación de los parámetros de cultivo individualmente o en grupos.

De acuerdo con una realización, el equipo se conecta a un sistema informático, mediante conexión dedicada o a través de una red telemática.

De este modo puede expandirse local o remotamente el sistema de manera indefinida para lograr el control de un número elevado de cultivos para aplicaciones de HTS.

En una realización, cada minibiorreactor comprende una tapa superior que incorpora un puerto óptico constituído por un tubo que penetra en el interior del minibiorreactor de manera que su extremo inferior está sumergido en un líquido contenido en dicho minibiorreactor.

Se evita así el efecto de las variaciones de nivel y de la condensación en las medidas ópticas que se realicen a través de dicho puerto óptico.

Se pueden situar sensores ópticos y fuentes de luz en el puerto óptico en la parte del fondo de la placa que se enfrenta a dicho puerto óptico y/o en la superficie lateral del recipiente.

Estos sensores tienen la finalidad de realizar medidas de absorción, reflexión, dispersión o fluorescencia del contenido del minibiorreactor.

También se pueden situar fibras ópticas o guías de luz en el puerto óptico, en la parte del fondo de la placa que se enfrenta a dicho puerto óptico y/o en la superficie lateral del recipiente.

Las fibras ópticas tienen la finalidad de realizar de forma remota medidas de absorción, reflexión, dispersión o fluorescencia del contenido del minibiorreactor.

En una realización se introduce un puerto adicional por la tapa superior de manera que el extremo de dicho puerto quede sumergido en el líquido, estando dicho extremo acabado por un filtro o membrana semipermeable.

Este puerto permite realizar medidas relacionadas...

1. Aparato para la realización simultánea y automatizada de un número elevado de cultivos biológicos en pequeño volumen y con condiciones controladas, similares a las que pueden obtenerse con biorreactores de gran escala, que comprende:

al menos una placa (1) de material plástico u otro material transparente, que comprende una pluralidad de minibiorreactores (2) para el cultivo en condiciones estériles, incluyendo cada minibiorreactor (2) un elemento de agitación individual (27) para permitir la homogeneización de su contenido,

caracterizado por el hecho de que cada minibioreactor (2) tiene un volumen de entre 5 y 25 ml y es estanco respecto al ambiente, a los demás minibiorreactores (2) y a un baño de termostatado común (6), e incluye puntos de acceso estériles (21,24,25,26) que permiten el llenado, inoculación, intercambio de gases, intercambio de líquidos y medida de parámetros; y por el hecho de que comprende además

un equipo (3) destinado a albergar al menos una placa (1) en su interior, introduciéndose las placas (1) a través de la apertura de al menos una parte de dicho equipo (3), comprendiendo dicho equipo (3) medios para el intercambio controlado de calor con el baño de termostatado (6), medios para la transmisión de energía a los elementos de agitación individuales (27), medios para el intercambio de gases a través de filtros estériles y medios para la monitorización no invasiva y/o para el control de los parámetros de los cultivos, donde dichos medios para el intercambio de gases y dichos medios para la monitorización y/o para el control de los parámetros de los cultivos comprenden sondas individuales y conexiones para cada minibioreactor, que pueden acoplarse simultáneamente con dichos puntos de acceso estériles del minibioreactor.

2. Aparato según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que cada placa (1) comprende además un agitador central (4) del baño de termostatado (6).

3. Aparato según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por el hecho de que la placa (1) comprende una pluralidad de minibiorreactores (2) individuales en disposición poligonal, con una zona central que facilita el termostatado común de dichos minibiorreactores (2).

4. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que el equipo (3) se conecta a un sistema informático (10,15), mediante conexión dedicada o a través de una red telemática.

5. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que cada minibiorreactor (2) comprende una tapa superior que incorpora un puerto óptico (21) constituido por un tubo que penetra en el interior del minibiorreactor de manera que su extremo inferior (22) está sumergido en un líquido (23) contenido en dicho minibiorreactor (2).

6. Aparato según la reivindicación 5, caracterizado por el hecho de que se sitúan sensores ópticos y fuentes de luz en el puerto óptico (21) en la parte del fondo de la placa (1) que se enfrenta a dicho puerto óptico (21) y/o en la superficie lateral del recipiente.

7. Aparato según las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado por el hecho de que se sitúan fibras ópticas o guías de luz en el puerto óptico (21), en la parte del fondo de la placa (1) que se enfrenta a dicho puerto óptico (21) y/o en la superficie lateral del recipiente.

8. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado por el hecho de que se introduce un puerto adicional (26) por la tapa superior de manera que el extremo de dicho puerto quede sumergido en el líquido (23), estando dicho extremo acabado por un filtro o membrana semipermeable.

9. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizado por el hecho de que se introduce un puerto adicional (26) por la tapa superior de manera que el extremo de dicho puerto quede sumergido en el líquido (23), conteniendo dicho extremo sensores o microsensores.

10. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que el intercambio de calor entre el equipo (3) y el baño de termostatado (6) de la placa (1) se lleva a cabo mediante una resistencia calefactora que está en contacto con una parte del perímetro exterior de la placa (1).

11. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que el intercambio de calor entre el equipo (3) y el baño de termostatado (6) de la placa (1) se lleva a cabo mediante una célula Peltier que está en contacto con una parte del perímetro exterior de la placa (1).

12. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que el intercambio de calor entre el equipo (3) y el baño de termostatado (6) de la placa (1) se lleva a cabo mediante una resistencia calefactora que está inmersa en dicho baño (6).

13. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que el intercambio de calor entre el equipo (3) y el baño (6) de la placa (1) se lleva a cabo mediante calentamiento por radiofrecuencia llevado a cabo desde el exterior.

14. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por el hecho de que comprende una sonda de temperatura sumergida en el baño de termostatado (6).

15. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por el hecho de que comprende sondas de temperatura sumergidas en el contenido (23) de uno o varios de los minibiorreactores (2).

16. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado por el hecho de que comprende un minibiorreactor adicional, rodeado igual que los demás minibiorreactores (2) por el baño de termostatado (6), en el cual se sumerge una sonda de temperatura.

17. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado por el hecho de que comprende un estátor situado debajo de cada uno de los elementos de agitación individual (27) del contenido de los minibiorreactores (2), para la transmisión de energía a dichos elementos de agitación (27).

18. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado por el hecho de que comprende imanes giratorios situados debajo de cada uno de los elementos de agitación individual (27) del contenido de los minibiorreactores (2), para la transmisión de energía a los distintos agitadores (27), girando dichos imanes gracias a un sistema mecánico de transmisión excitado por un motor eléctrico común.

19. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado por el hecho de que comprende imanes giratorios situados debajo de cada uno de los elementos de agitación individual (27) del contenido de los minibiorreactores (2), para la transmisión de energía a los distintos agitadores (27), girando dichos imanes gracias a motores eléctricos individuales.

20. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 19, caracterizado por el hecho de que comprende un estátor o un imán giratorio situado debajo del agitador central (4) del baño de termostatado (6), para la transmisión de energía a dicho agitador (4).

21. Aparato según la reivindicación 2 y cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado por el hecho de que comprende medios para provocar el giro del agitador (4) del baño común de termostatado (6) a partir de la secuenciación de las excitaciones a los minibiorreactores (2).

22. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que las placas (1) son al menos en parte desechables.

23. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de que las placas (1) están formadas por una base realizada en material plástico y al menos una tapa realizada en material plástico u otro material transparente.

24. Método para la realización simultánea y automatizada de un número elevado de cultivos biológicos en pequeño volumen y con condiciones controladas, de manera que dichas condiciones sean similares a las que pueden obtenerse con biorreactores de gran escala, que comprende:

realizar cultivos en condiciones estériles en una pluralidad de minibiorreactores (2) dispuestos en al menos una placa (1) de material plástico u otro material transparente, comprendiendo cada minibiorreactor (2) un elemento de agitación individual (27) para permitir la homogeneización de su contenido,

caracterizado por el hecho de que cada minibiorreactor (2) tiene un volumen de entre 5 y 25 ml, y cada uno de dichos minibioreactores es estanco respecto al ambiente, a los demás minibiorreactores (2) y a un baño de termostatado común (6), e incluye puntos de acceso estériles (21,24,25,26) que permiten el llenado, inoculación, intercambio de gases, intercambio de líquidos y medida de parámetros; y por el hecho de que el método comprende además

introducir al menos una placa (1) en el interior de un equipo (3) que comprende medios para el intercambio controlado de calor con el baño de termostatado (6), medios para la transmisión de energía a los elementos de agitación individuales (27), medios para el intercambio de gases a través de filtros estériles y medios para la monitorización no invasiva y/o control de los parámetros de los cultivos, donde dichos medios para el intercambio de gases y dichos medios para la monitorización y/o el control de los parámetros de los cultivos comprenden sondas individuales y conexiones para cada minibioreactor, que pueden acoplarse simultáneamente con dichos puntos de acceso estériles del minibioreactor; y

monitorizar de forma no invasiva y/o controlar los parámetros de los cultivos.