SISTEMA DE FERMENTACION IN VITRO CON FLUJO DISCONTINUO DE LAS FASES LIQUIDA Y SOLIDA.

Sistema de fermentación in vitro con flujo discontinuo de las fases líquida y sólida.

La presente invención se refiere a un sistema de fermentación in vitro con flujo discontinuo de las fases líquida y sólida que tiene aplicación en el campo de la producción animal, especialmente, en la valoración nutritiva de alimentos para rumiantes y otros herbívoros. Este sistema puede aplicarse como herramienta de simulación in vitro por grupos de investigación que mantengan líneas enfocadas al estudio del ecosistema microbiano digestivo y los procesos de fermentación digestiva, así como de los factores que inciden sobre ellos

Sistema de fermentación in vitro con flujo discontinuo de las fases líquida y sólida.

Objeto de la invención

La presente invención se refiere a un sistema de fermentación in vitro con flujo discontinuo de las fases líquida y sólida que tiene aplicación en el campo de la producción animal, especialmente, en la valoración nutritiva de alimentos para rumiantes y otros herbívoros.

Antecedentes de la invención

En los animales herbívoros, la utilización digestiva del alimento depende en gran medida de la interacción digestiva con su ecosistema microbiano digestivo, compuesto por un amplio número de especies de bacterias, protozoos y hongos, establecido en uno o varios compartimentos del tracto digestivo. Esta variada población microbiana fermenta los componentes del alimento rindiendo productos útiles para el balance energético del hospedador. Por tanto, en los herbívoros, la fisiología digestiva y en último término la valoración nutritiva dependen en gran medida de la determinación del potencial de fermentación de la población microbiana, que a su vez está determinado por el tipo de alimento, las condiciones ambientales de fermentación, y con ellas las características de la población microbiana, además de por el tiempo de permanencia del alimento en el órgano de fermentación.

Los estudios de fisiología digestiva y valoración nutritiva in vivo son laboriosos y costosos, por lo que desde hace décadas se han propuesto alternativas in vitro que permitan estimar las características de la fermentación microbiana a partir de simulaciones en laboratorio. Las diferencias entre ellas residen en el compromiso entre el grado de simplicidad del sistema, en función del número de variables que afectan a la fermentación que se controlen, y la exactitud y precisión que se pretende alcanzar con los resultados. Además, el diseño de los sistemas varía en función de su enfoque hacia los parámetros específicos que se pretenden medir.

Como consecuencia de las diferencias entre los sistemas de fermentación en cuanto a su simplicidad, el rango de variación de su coste económico es extremadamente amplio. Czerkawski (1986) clasifica los distintos tipos de sistemas de fermentación in vitro en: sistemas sin intercambio de sólido o líquido, sistemas de flujo continuo y sistemas semipermeables. Los primeros consisten en un tubo o botella de vidrio en el que se incuba durante cierto tiempo un sustrato determinado con una mezcla de inóculo microbiano con distintas proporciones de soluciones tampón para mantener un pH constante óptimo para la actividad microbiana, de minerales y una solución reductora para minimizar la concentración de oxígeno en el medio. La temperatura del sistema se controla manteniendo la incubación en una estufa o en un baño de agua. En algunos casos, el contenedor dispone de una válvula tipo Bunsen para permitir la salida de los gases de fermentación producidos (Tilley y Terry 1963), estimando la fermentación gravimétricamente, por diferencia en función del residuo de incubación. En otros, la fermentación se estima en función del volumen de gas producido en el contenedor, bien a presión constante mediante el desplazamiento del émbolo de jeringas de vidrio en las que se realiza la incubación (Menke y col. 1979) o bien a volumen constante, registrando los cambios de presión en una botella cerrada (Theodorou y col. 1994). En las dos últimas décadas se han registrado algunas variantes de este último sistema, según la medición del gas producido sea manual (Beuvink y Spoelstra 1992; Theodorou y col. 1994) o automática (Pell y Schofield 1993; Cone y col. 1996; Davies y col. 2000).

La determinación de la fermentación microbiana de los alimentos mediante la producción de gas se ha difundido por numerosos laboratorios de alimentación animal en todo el mundo, debido a que aporta un valor más ajustado de la fermentación que la estimación gravimétrica y permite seguir en el tiempo la cinética de fermentación con un elevado número de muestras. Además, los sistemas más sencillos (Menke y col. 1979; Theodorou y col. 1994) cuentan con la ventaja de un fácil manejo y bajo coste.

Sin embargo, estos sistemas no tienen en cuenta el efecto del flujo de líquido y sólido sobre la eficiencia de síntesis microbiana y la retroinhibición de la actividad enzimática, por lo que pueden conducir a desviaciones en la estimación de la fermentación.

En los sistemas de cultivo continuo, éste es previamente inoculado con microorganismos, y una solución tampón se bombea continuamente al contenedor, aunque el flujo de salida del rumen no es realmente constante en condiciones fisiológicas. El flujo de salida del líquido se establece por salida a través de un filtro o por simple extravasación. El material sólido se administra en dosis repartidas en el tiempo (Hoover y col. 1976; Teather y Sauer 1988) o mediante introducción escalonada en bolsas de nylon, como en el Rusitec (Czerkawski y Breckenridge 1977) o en el Cositec, una adaptación de este último a los monogástricos (Stuck y col. 1995). Excepto en el caso del modelo de Teather y Sauer, basado en la estratificación del contenido del fermentador y su salida homogénea, de forma similar a la del contenido ruminal, los otros modelos se basan en un flujo diferente de entrada/salida de las fases sólida y líquida para mantener estables las poblaciones microbianas, tanto bacterias como protozoos, más sensibles a un flujo rápido.

Sin embargo, este tipo de aparatos no son aptos para incubaciones a corto plazo, ya que requieren varios días para alcanzar el equilibrio. Además, para el control de cada una de las vasijas de estos modelos de fermentación, todos ellos requieren una bomba peristáltica para la infusión de solución líquida y salida de efluente, un sistema de regulación constante del pH mediante infusión de solución ácida o básica, y un sistema de agitación, de control de temperatura y de flujo continuo de gas para mantener las condiciones de anaerobiosis.

Además, el modelo de Hoover incluye un sistema de alimentación de distribución automática. Estos aparatos confieren complejidad a los sistemas, además de suponer un precio considerable.

Basándose en que la pared ruminal es semipermeable, algunos autores han intentado simular in vitro las condiciones de fermentación mediante el uso de membranas semipermeables de diálisis para el flujo diferenciado de la fase líquida, con el fin de hacerlo más próximo a la situación in vivo. Abe y Kumeno (1973) y Nakamura y Kurihara (1978) desarrollaron modelos de este tipo, pero con el inconveniente de una gran complejidad y de no poder utilizar sustratos sólidos.

Una demostración de su escasa aplicabilidad es que estos modelos no han sido utilizados de nuevo, ni siquiera por sus creadores.

Una versión más simple, enfocada inicialmente a la fermentación en monogástricos, es la propuesta por Iversen y col. (1989), aunque este modelo sólo controla el flujo de fase líquida, y está enfocado básicamente al estudio de cambios en las poblaciones microbianas, y no a la estimación de los procesos fermentativos.

Para evitar los inconvenientes que estos sistemas de cultivo continuo tienen, tanto en su capacidad de simular las condiciones de fermentación ruminal como, sobre todo, en su potencial de aplicación en condiciones prácticas, se proporciona el presente sistema de fermentación in vitro.

El sistema que aquí se describe puede aplicarse como herramienta de simulación in vitro por grupos de investigación que mantengan líneas enfocadas al estudio del ecosistema microbiano digestivo y los procesos de fermentación digestiva, así como de los factores que inciden sobre ellos. Del mismo modo, puede emplearse por laboratorios agropecuarios como técnica rutinaria de valoración de alimentos para rumiantes, caballos, conejos y otros herbívoros, con objeto de estimar parámetros digestivos y rendimientos productivos del ganado, así como por distintas empresas dedicadas a la alimentación animal, para valorar el potencial de distintos tratamientos físicos y químicos de los alimentos, o de aditivos incorporados en la dieta de los herbívoros.

Descripción

El sistema de fermentación in vitro con flujo discontinuo de las fases líquida y sólida comprende al menos una unidad de fermentación bajo condiciones, la cual está provista en su parte superior de una primera boca, inclinada respecto del eje de altura de la unidad. La primera boca estará provista de un tapón/septum de goma sujeto por...

1. Sistema de fermentación in vitro con flujo discontinuo de las fases líquida y sólida que comprende al menos una unidad de fermentación bajo condiciones, la cual está provista en su parte superior de una primera boca (1), inclinada respecto del eje de altura de la unidad, caracterizado porque dispone de una segunda boca (2), situada perpendicularmente a la base de la unidad, a través de la cual se inocula y extrae periódicamente la fase líquida mediante un elemento tubular (3) que la atraviesa, introduciéndose parcialmente en dicha unidad, y que se conecta, por su extremo situado en el exterior de la unidad, a una válvula de dos vías (5), en tanto que su extremo alojado en la unidad está provisto, adherido a él, de un medio filtrante (4), mientras que dicha primera boca (1) está configurada para la introducción de la fase sólida y para ser atravesada por un elemento punzante (7) que discurre hasta el interior de la unidad, cuyo extremo no punzante conecta con una sonda de presión (6) que actúa en un intervalo de presión entre 0 y 1 bar, y porque se mantiene dicha unidad de fermentación en condiciones de incubación a una temperatura entre 37 y 39ºC.

2. Sistema de fermentación in vitro según la reivindicación 1, caracterizado porque el elemento tubular (3) se introduce hasta que su extremo alcanza el último tercio de la altura de la unidad de fermentación.

3. Sistema de fermentación in vitro según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el medio filtrante (4) consiste en una malla de nailon.

4. Sistema de fermentación in vitro según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la fase sólida que pasa a través de la primera boca (1) consiste en bolsas de nylon porosas.