Molécula de ácido nucleico de doble cadena aislada que comprende un promotor bidireccional,

que comprende en la dirección 3' a 5' en una primera cadena

(a) una secuencia que comparte por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº:7 o la SEQ ID Nº: 10, y

(b) una secuencia que comparte por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID Nº:8 o la SEQ ID Nº:11,

en la que dicho promotor bidireccional, cuando se une operablemente a una primera secuencia de codificación de una proteína heteróloga en dirección antisentido y una segunda secuencia de codificación de una proteína heteróloga en dirección sentido, dirige la expresión de dichas secuencias a niveles más altos en semillas que en otras células y tejidos

Secuencias de promotores asociados a semillas.

Antecedentes de la invención

El campo de la invención es el de promotores asociados a semillas de plantas.

Existe un interés considerable en la identificación y aislamiento de elementos regulatorios que controlan la expresión génica en las semillas de plantas; tales promotores asociados a semillas y específicos de semilla pueden utilizarse en la generación de plantas transgénicas con las características de semilla deseadas. Por ejemplo, resultan útiles elementos regulatorios específicos de semilla para manipular el metabolismo de lípidos, especialmente la síntesis de ácidos grasos en la semilla, y para mejorar las características agronómicas como la resistencia a los herbicidas y pesticidas y la tolerancia a la sequía.

Los genes de proteínas de almacenamiento de la semilla se encuentran entre los genes de plantas más estrechamente regulados. La expresión de proteínas de almacenamiento de la semilla es altamente específica para semillas, y las transcripciones correspondientes se acumulan a niveles elevados en la fase media a tardía del desarrollo de la semilla. Se han clonado muchos genes de proteínas de almacenamiento de semilla a partir de especies de plantas diversas, y se han analizado en detalle sus promotores (véase, p. ej., Thomas, 1993, Plant Cell 5:1401-1410). Los elementos promotores, que constituyen las regiones reguladoras aguas arriba 5', se han definido funcionalmente por su capacidad de conferir una expresión específica de semilla del gen reporter de la beta-glucuronidasa bacteriana (GUS) en plantas transgénicas (p. ej., Bogue et al. 1990, Mol Gen Genet 222:49-57; Bustos et al. 1989, Plant Cell 1:839-853). El análisis de la deleción de estos promotores ha permitido a los investigadores definir unas regiones dentro de cada promotor que resultan críticas para su regulación global (Bustos et al. 1991, EMBO J 10:1469-1479; Chung, 1995, Ph.D. Dissertation, Texas A&M University; Nunberg et al 1994, Plant Cell 6:473-486).

En algunos casos, se han mapeado los elementos reguladores cis y se han clonado los factores de transactivación que confieren funcionalidad. Se han descubierto elementos en cis que regulan la expresión de proteínas de almacenamiento de semilla en genes de una variedad de especies de plantas que incluyen el arroz, girasol, judías verdes y semillas de soja. Se han identificado las secuencias conservadas de nucleótidos que se encuentran comúnmente en las regiones reguladoras específicas de semilla e incluyen la caja legumina (leg-box) que comprende un elemento básico de CATGCATG, también denominado elemento de repetición RY.

El promotor napin (del gen napA que codifica la proteína de almacenamiento 2S de Brassica napus) se utiliza ampliamente para controlar la expresión de los genes biosintéticos de lípidos en plantas transgénicas (Josefsson et al., 1987, J Biol Chem 262:12196-201; Stalberg et al., 1993, Plant Mol Biol 23:671-83; Ellerstrom et al., 1996, Plant Mol Biol 32:1019-27). El promotor oleosina de Brassica napus dirige la expresión del gen reporter en el embrión y endosperma (Keddie et al., 1994, Plant Mol Biol 24:327-40). En Arabidopsis, el promotor FAE1 se ha utilizado para controlar la expresión del reporter GUS al desarrollar embriones, donde la actividad se detectó tan pronto como 4-5 días después de la fertilización (Rossak et al., 2001, Plant Mol Biol 46:717-25). El promotor de la legumina (LeB4; Baumlein et al., 1991, Mol Gen Genet 225:121-8; Baumlein et al., 1992, Plant J 2:233-9) de la legumbre Vicia faba también se ha caracterizado funcionalmente y ha demostrado promover la expresión específica de semilla de genes heterólogos. La caracterización de los promotores específicos de semilla se reviso en Goossens et al., 1999 (Plant Pyhsiol 120:1095-1104).

La gran mayoría de promotores de plantas nativos son unidireccionales, con un promotor aguas arriba (5') que dirige sólo un gen que es 3' respecto al promotor. Existen promotores bidireccionales en algunos procariotas y virus, y se han identificado promotores bidireccionales que son activos en plantas a partir de patógenos de plantas virales (geminivirus; Frey et al., 2001, Virus Genes 22:231-42) y bacterianos (Agrobacterium; Schmulling et al., 1989, Plant Cell 1:665-70; Leung et al., 1991, Mol Gen Genet 230:463-74). Se ha propuesto una estrategia para desarrollar promotores bidireccionales, básicamente añadiendo una región promotora mínima al extremo aguas arriba de un promotor unidireccional (Xie et al., 2001, Nat Biotechnol 19:677-9). Además, se ha caracterizado un promotor bidireccional de Brassica napus en el que la región reguladora controla la expresión específica de semilla en una dirección mientras en la orientación opuesta, el promotor dirige la expresión en una variedad de tejidos que incluyen las hojas y las raíces (Keddie et al., 1994, Plant Mol Biol 1994 24:327-40; Sadanandom et al., 1996, Plant J 10:235-42). Sin embargo, no se han descrito promotores de plantas que controlen la expresión asociada a semilla en ambas orientaciones.

Las globulinas y las albúminas son proteínas de almacenamiento de semilla comunes en las plantas dicotiledóneas (dicots). Estas proteínas pueden distinguirse una de otra en base a la solubilidad diferencial; las albúminas son solubles en agua, mientras que las globulinas son solubles en soluciones salinas. En muchas dicots, incluyendo los cítricos y la almendra (Prunus amygdalus), las globulinas 12S son las proteínas de almacenamiento de semilla más prevalentes. Las globulinas 12S son proteínas multiméricas compuestas por subunidades de dímero. Cada dímero contiene una subunidad alfa de 30-40 kDa y una subunidad beta de 20 kDa. Las subunidades de dímero se derivan de un polipéptido precursor simple que experimenta varias modificaciones post-traduccionales, que incluyen el clivaje de un péptido señal seguido del clivaje de la pre-proteína en las subunidades alfa y beta.

Se han aislado de la almendra dos clones de cADN de longitud completa que codifican proteínas de almacenamiento de semilla de la globulina 12S de la prunina (Pru1 y Pru2) (Prunus amygdalus cv Texas; Garcia-Mas et al., 1995, Plant Mol Biol 27:205-10). Cada transcripción codifica una pre-proteína que se procesa para crear las subunidades alfa y beta que comprenden la proteína de almacenamiento de semilla madura de ~60 KDa. A nivel de aminoácido, la Pru1 y Pru2 son idénticas en un 63% a la Pru2 que contiene dos separaciones en la región que corresponde a la subunidad alfa. Las dos transcripciones de prunina son específicas de semilla y se encuentran entre los más abundantes en las semillas inmaduras. Aparentemente las principales proteínas de almacenamiento en la almendra son globulinas tipo legumina que consisten en dos pares de polipéptidos, cada par codificado por un único gen (Garcia-Mas et al., 1995).

Resumen de la invención

De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona un constructo de ácido nucleico según se define en la reivindicación 1. La invención abarca un promotor bidireccional (PRU) que tiene una actividad de promotores asociados a semilla que comprende en la dirección 3' a 5', las siguientes regiones: (a) una secuencia del promotor mínimo que contiene una caja TATA, y (b) una secuencia que confiere la especificidad de semilla que contiene un motivo con similitud al consenso caja legumina CATGCATG. En algunas formas de realización el promotor PRU comprende adicionalmente (c) un motivo de secuencia aguas arriba que se predice que funciona como elemento potenciador. El promotor PRU es bidireccional, teniendo una cadena complementaria que también comprende unas regiones (a) y (b), y opcionalmente (c). En una forma de realización de la invención, el promotor PRU bidireccional se utiliza en un vector de expresión de doble cadena de la planta que comprende, en la orientación 5' a 3', una primera secuencia de codificación de una proteína heteróloga en dirección antisentido, el promotor PRU, y una segunda secuencia de codificación heteróloga en dirección sentido, en la que el promotor PRU dirige la expresión asociada a semilla de la primera y de la segunda secuencia de codificación de una proteína heteróloga. De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un vector de expresión en plantas según se define en la reivindicación 9. De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona una célula de planta transgénica según la reivindicación...

1. Molécula de ácido nucleico de doble cadena aislada que comprende un promotor bidireccional, que comprende en la dirección 3' a 5' en una primera cadena