PROTEINAS RECOMBINANTES DE UNA CEPA PAQUISTANI DE HEPATITIS E Y SU UTILIZACION EN METODOS DE DIAGNOSTICO Y VACUNAS.

SE DESCUBRE UN LINAJE DEL VIRUS DE HEPATITIS E DE PAQUISTAN (SAR55) IMPLICADO EN LA HEPATITIS NO-A,

NO-B TRANSMITIDA EPIDEMICA O ENTERICAMENTE, AHORA LLAMADO HEPATITIS E. EL INVENTO SE REFIERE A LA EXPRESION DE LA REGION ESTRUCTURAL TOTAL DE SAR-55, DESIGNADO ESTRUCTURA 2 DE LECTURA ABIERTA (ORF-2), EN UN SISTEMA DE EXPRESION EUCARIOTICA. LA PROTEINA EXPRESADA ES CAPAZ DE FORMAR PARTICULAS PARECIDAS AL VIRUS HEV QUE PUEDEN SERVIR COMO ANTIGENOS EN INMUNOENSAYOS DE DIAGNOSTICO Y COMO INMUNOGEN O VACUNA PARA PROTEGER CONTRA INFECCION POR HEPATITIS E

Proteínas recombinantes de una cepa paquistaní de hepatitis E y su utilización en métodos de diagnóstico y vacunas.

El invento es en el campo de la virología de la hepatitis. Más específicamente, este invento se refiere a un método para producir una proteína de hepatitis inmunogénica, a saber, la expresión de una secuencia que codifica el marco de lectura abierta 2 completo del virus de la hepatitis E en una célula hospedante de insecto transformada o transfectada con un vector de expresión de baculovirus que comprende dicha secuencia codificante, al vector de expresión de baculovirus y a la célula hospedante de insecto.

Las epidemias de hepatitis E, una hepatitis no-A/no-B entéricamente transmitida, ha sido documentada en Asia, África y América Central (Balayan, M. S, (1987), Soviet Medical Reviews, Section E, Virology Reviews, Zhdanov, V. M. (ed), Chur, Suiza: Harwood Academic Publishers, vol. 2, 235-261; Purcell, R. H. y otros (1988) en Zuckerman. A. J. (ed), Viral Hepatitis and Liver Disease, Nueva York: Alan R. Liss, 131-137; Bradleay, D. W. (1990), British Medical Bulletin, 46; 442-461; Ticehurst, J. R. (1991) en Hollinger, F. B., Lemon, S. M., Margolis, H. S. (eds); Viral Hepatitis and Liver disease, Williams and Wilkins, Baltimore, 501-513). Los casos de hepatitis esporádica, que se suponen son de hepatitis E, dan cuenta de hasta el 90% de las hepatitis documentadas en países donde el virus de la hepatitis E (HEV) es endémica. La necesidad para el desarrollo de un ensayo serológico para la detección de anticuerpos anti-HEV en el suero de individuos infectados es ampliamente reconocida en el campo, pero la concentración tan baja de HEV secretada por los humanos o animales infectados hizo imposible usar tal HEV como fuente de antígenos para ensayos serológicos y aunque el éxito limitado fue documentado en la propagación de HEV en cultivos celulares (Huang, R. T y otros (1992), J. Gen. Virol., 73: 1143-1148), el cultivo celular es actualmente demasiado ineficaz para producir las cantidades de antígeno requeridas para ensayos serológicos.

Recientemente, esfuerzos importantes en todo el mundo para identificar secuencias genómicas virales asociadas con la hepatitis E han resultado en el clonaje de los genomas de un número limitado de cepas de HEV (Tam, A. W. Y otros. (1991), Virology, 185: 120-131; Tsarev, S. A y otros (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 559-563; Fry, K. E. y otros (1992), Virus Genes, 6: 173-185). Los análisis de secuencias de ADN han llevado a los investigadores a hipotetizar que el genoma de HEV está organizado en tres marcos de lectura abiertos (ORFs) y a hipotetizar que estos ORFs codifican proteínas HEV intactas.

Una secuencia de ADN parcial del genoma de una cepa HEV de Burma (Myanmar) está descrita en Reyes y otros. 1990, Science, 247: 1335-1339. Tam y otros, 1991, y Reyes y otros, solicitud de patente PCT WO 91/15603 publicada el 17 de Octubre, 1991 describe la secuencia nucleotídica completa y una secuencia aminoacídica deducida de la cepa de Burma de HEV. Estos autores hipotetizaron que tres marcos de lectura abiertos (ORF) están contenidos dentro de las secuencias de esta cepa.

Ichikawa y otros, 1991, Microbiol. Immunol., 35: 535-543, describe el aislamiento de una serie de clones de 240-320 nucleótidos en longitud tras el cribado de una librería de expresión lgt11 con sueros de monos cynomolgus infectados con HEV. La proteína recombinante expresada por un clon fue expresada en E. Coli. Esta proteína de fusión está codificada por la región 3' de ORF-2 de la cepa de Myanmar de HEV.

La expresión de proteínas adicionales codificadas en la región 3' de ORF-2 de una cepa mejicana de HEV y de una cepa burmesa de HEV está descrita en Yarbough y otros, 1991 J: Virology, 65: 5790-5797. Este artículo describe el aislamiento de dos clones de cADN derivados de HEV. Estos clones codifican las proteínas en la región 3' de ORF-2. Los clones fueron expresados en E. Coli como proteínas de fusión.

Purdy y otros, 1992, Archives of Virology, 123: 335-349, y Favorov y otros, 1992. J. of Medical Virology, 36: 246-250, describe la expresión de un fragmento de proteína ORF-2 de la cepa de Burma en E. Coli. Estas referencias así como las previamente descritas, sólo describen la expresión de una porción del gen ORF-2 usando sistemas de expresión bacterianos. La expresión con éxito de la proteína ORF-2 de longitud completa no ha sido descrita hasta el presente invento.

La comparación de la organización del genoma y la estructura morfológica de HEV con la de los torovirus reveló que el HEV está mas íntimamente relacionado con los calicivirus. Es interesante que las proteínas estructurales de calicivirus están codificadas por la porción 3' de su genoma (Neil, J.D. y otros (1991) J. Virol., 65: 5440-5447; y Carter, M. J. y otros (1992), J. Arch. Virol., 122: 223-235) y aunque no hay evidencia directa de que la parte 3' terminal del genoma de HEV también codifique las proteínas estructurales, expresión de ciertas porciones pequeñas de la región 3' del genoma en las células de bacteria dio como resultado la producción de proteínas reactivas con suero anti-HEV en ELISA y transferencias Western (Yarborough, y otros, (1991); Ichikawa y otros, (1991), Vavorov y otros (1992) y Dwason, G. J y otros (1992) J. Virol. Meth; 38: 175-186). Sin embargo, la función de la proteína ORF-2 como una proteína estructural no se demostró hasta el presente invento.

Las proteínas pequeñas codificadas por una porción del gen ORF-2 han sido usadas en inmunoensayos para detectar anticuerpos frente a HEV en sueros de animales. El uso de proteínas pequeñas expresadas en bacterias como antígenos en inmunoensayos serológicos tiene varias desventajas posibles. Primero, la expresión de estas proteínas pequeñas en células de bacterias dan como resultado con frecuencia problemas de solubilidad y reactividad cruzada no específica de sueros de pacientes con proteínas de E. Coli cuando lisados de E. Coli en bruto son usados como antígenos en inmunoensayos (Purdy y otros (1992)). Segundo, el uso de transferencias Western como ensayos serológicos de elección para anticuerpos anti-HEV en epidemiología rutinaria es impráctico debido a las limitaciones de tiempo y de costes. Un ELISA que usa péptidos pequeños derivados de la parte 3' terminal del genoma HEV resultó en la detección de sólo 41% positivos de pacientes diagnosticados infectados por HEV. Tercero, se ha mostrado que para muchos virus, incluyendo Picornaviridae que es la familia más cercana a Caliciviridae, epítopos antigénicos e inmunogénicos importantes son altamente conformacionales (Lemon, S. M. y otros (1991), en Hollinger, F. B., Lemon, S.M., Margolis, H. S. (eds): Viral Hepatitis and Liver Disease, Williams and Wilkins, Baltimore, 20-24). Por esta razón, se cree que la expresión en un sistema eucariótico de un ORF completo que codifica un gen HEV intacto daría como resultado la producción de una proteína que podría formar partículas de tipo HEV-virales. Tal proteína ORF completa tendría una estructura inmunológica más cercana a la de una proteína de cápside nativa que las proteínas más pequeñas anteriormente mencionadas que representan sólo porciones de las proteínas estructurales de HEV. Por lo tanto, estas proteínas ORF completas muy probablemente servirían como un antígeno más representativo y un inmunógeno más eficiente que las proteínas más pequeñas actualmente usadas.

El presente invento se refiere a:

Un método para producir una proteína de hepatitis inmunogénica que comprende:

Preferiblemente, el presente invento se refiere al método anterior, en el que dicha secuencia de ADN consiste en:

a) nucleótidos 5147 a 7126 de la SEQ ID Nº: 4,

b) una secuencia de ADN que codifica la secuencia aminoácido de la SEQ ID Nº: 2 o

c) una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene más del 90% de homología con la secuencia aminoacídica de la SEQ ID Nº:2.

Por otro lado, el presente invento se refiere a un vector de expresión de baculovirus...

1. Un método para producir una proteína de hepatitis inmunogénica que comprende:

2. Un método de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de ADN consiste en:

a) nucleótidos 5147 a 7126 de la SEQ ID Nº 4,

b) una secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 2, ó

c) la secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene más del 90% de homología con la secuencia aminoacídica de la SEQ ID Nº: 2.

3. Un vector de expresión de baculovirus que comprende ADN, teniendo dicho ADN una secuencia, consistiendo dicha secuencia en nucleótidos que codifican los aminoácidos 1 a 660 de una proteína de marco de lectura abierta 2 del virus de la hepatitis E.

4. El vector de expresión de la reivindicación 3, en el que dicha secuencia de ADN consiste en:

a) nucleótidos 5147 a 7126 de la SEQ ID Nº: 4

b) una secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nº: 2, ó

c) una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos que tiene más del 90% de homología con la secuencia aminoacídica de la SEQ ID Nº: 2

5. Una célula hospedante de insecto que comprende el vector de expresión de la reivindicación 3 ó 4.