Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada entre:

(a) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por VLSNDVCAQV (ID de SEC nº: 3), YISNDVCAQV (ID de SEC nº: 4) e YLSNDVCAQV (ID de SEC nº: 5);

(b) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por la ID de SEC nº: 26, la ID de SEC nº: 28 y la ID de SEC nº: 30;

(c) una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada del grupo constituido por la ID de SEC nº: 20, la ID de SEC nº 21 y la ID de SEC nº: 22;

(d) una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria de una secuencia nucleótida de uno de (a) a (c)

Péptidos agonistas de antígenos específicos de la próstata, y usos de los mismos.

Antecedentes de la invención

La presente invención versa acerca de péptidos aislados que comprenden epítopes agonistas de antígenos específicos de la próstata (PSA). En un aspecto, la presente invención versa acerca de péptidos que comprenden epítopes agonistas del epítope de PSA-3 CTL (linfocito T citotóxico). La invención también versa acerca de ácidos nucleicos (por ejemplo, vectores víricos recombinantes) que codifican péptidos que comprenden epítopes agonistas de PSA-3, al igual que células anfitrionas que comprenden estos ácidos nucleicos, y anticuerpos que se unen a estos péptidos. También están relacionadas las composiciones farmacéuticas que comprenden los ácidos nucleicos y los péptidos de la invención, al igual que procedimientos de tratamiento del cáncer de próstata que emplean dichas composiciones, por ejemplo, inmunoterapia mediada por péptidos y mediada por vectores.

El tratamiento actual para el cáncer de próstata conlleva cirugía, radiación, quimioterapia y/o terapia hormonal. A pesar de estos tratamientos, más de 40.000 hombres mueren de cáncer de próstata cada año solo en los EE. UU. (C.C. Boring et al., 1994, CA Cancer J. Clin. 44: 7-26). Una modalidad prometedora para el tratamiento del cáncer de próstata implica una terapia con vacunas. El antígeno específico de la próstata (PSA), un antígeno expresado en carcinoma de próstata, es un objetivo importante para la terapia con vacunas (K.W. Watt et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 83: 3166-3170). Aunque el PSA se expresa en el epitelio normal de la próstata, no se expresa en ningún nivel apreciable en otros tejidos adultos normales. Sin embargo, el PSA es un "autoantígeno", dando lugar a una inmunotolerancia.

Se han llevado a cabo dos ensayos clínicos de vacuna utilizando un virus vaccinia recombinante que expresa el gen PSA (rV-PSA) como un inmunogén. Estos estudios demostraron que se podían inducir tanto respuestas de anticuerpos anti-PSA (M.G. Sanda et al., 1999, Urology 53: 260-266) como respuestas de célula T específica a PSA (J.P. Eder et al., 2000, Clin. Cancer Res. 6: 1632-1638) en pacientes vacunados. En un ensayo, se indujeron las respuestas de célula T a péptido PSA 10-mer en cinco de siete pacientes con cáncer de próstata después de la vacunación con rV-PSA. Se obtuvieron estos resultados utilizando un ensayo ELISPOT en el que se incubaron durante la noche PBMC de pacientes con APC (células que presentan antígenos) pulsadas con péptidos. Se utilizó el breve periodo de incubación para evitar artefactos debidos a ciclos prolongados de estimulación de péptidos in vitro de células T (J.P. Eder et al., 2000, Clin. Cancer Res. 6: 1632-1638). Notablemente, no se observó ninguna respuesta de célula T específica a PSA cuando se utilizaron PBMC antes de la vacunación con rV-PSA.

El péptido utilizado para monitorizar las respuestas inmunes en pacientes que recibieron rV-PSA fue un péptido 10-mer que se une a HLA-A2, designado PSA-3 (VISNDVCAQV; ID de SEC nº: 1; P. Correale et al., 1997, J. Natl. Cancer Inst. 19: 293-300; P. Correale et al., 1998, J. Immunol. 161: 3186-3194). Se utilizó el péptido que se une a HLA-A2 para monitorizar pacientes que daban positivo para el alelo HLA-A2. Se escogió monitorizar los pacientes que poseían el alelo HLA-A2 porque es el alelo HLA más habitual en individuos en América del Norte y se expresa en aproximadamente el 50% de la población caucásica (J. Lee, 1990, "The HLA system: a new approach" Proceedings Of The First Red Cross International Histocompatibility Workshop SpringerVerlag, Nueva York, EE. UU., p. 154).

Estudios anteriores también demostraron que el epítope de PSA-3 era procesado de forma natural por las células tumorales, y se unía a moléculas MHC A2 de clase I en la superficie de las células de cáncer de próstata. Esta unión hacía a las células de la próstata susceptibles a lisis por células T específicas de una forma restringida a MHC (P. Correale et al., 1998, J. Immunol. 161: 3186-3194). Además, estudios anteriores analizaron la secuencia de aminoácidos de la molécula de PSA utilizando tanto algoritmos informáticos, como estudios de unión de péptidos a la línea celular T2A2 con HLA-A2 positivo (K.S. Anderson et al., 1993, J. Immunol. 151: 3407-3419). Los estudios también analizaron la capacidad de diversos péptidos de PSA para generar líneas CTL in vitro. Este análisis demostró que el péptido de PSA-3 era óptimo para estas propiedades.

Se utilizó subsiguientemente el péptido de PSA-3 en el ensayo ELISPOT para monitorizar las respuestas inmunes en pacientes vacunados (J.P. Eder et al., 2000, Clin. Cancer Res. 6: 1632-1638; P. Arlen et al., 2000, Cancer Immuno. Immunother. 49: 517-529). Los resultados de estos estudios indicaron que los aumentos observados en las frecuencias precursoras en el ensayo ELISPOT como resultado de la vacunación con rV-PSA fueron relativamente modestos (es decir, entre el doble y el cuádruple) (J.P. Eder et al., 2000, Clin. Cancer Res. 6: 1632-1638). Por lo tanto, existe la necesidad en la técnica de composiciones y procedimientos para mejorar la inmunogenicidad de los PSA.

Por lo tanto, la presente invención describe composiciones y procedimientos para aumentar la inmunogenicidad de los PSA, al igual que tratamientos que emplean estas composiciones y procedimientos. Conforme a la presente invención, se aumentó la inmunogenicidad de los péptidos de PSA al modificar los residuos de aminoácidos que interactúan con las moléculas HLA. Estudios anteriores han demostrado que la modificación de aminoácidos en los residuos de anclaje de los péptidos puede tener como resultado una unión mejorada a MHC y una activación mejorada de las células T, mientras que otras modificaciones de aminoácidos no tendrán ningún efecto ni actuarán para antagonizar la activación de las células T (H.M. Grey et al., Cancer Surv. 22: 37-49; M.T. De Magistris et al., 1992, Cell 68: 625-632, S.C. Jameson et al., 1995, Immunity 2: 1-11; S. Zaremba et al., 1997, Cancer Res. 57: 4570-4577). Se ha demostrado la mejora de la activación de las células T al modificar los residuos de anclaje de HLA para algunos antígenos asociados con el melanoma humano (D. Valmori et al., 1998, J. Immunol. 160: 1750-1758, 1998; Y. Kawakami, Y., Eliyahu et al., 1995, J. Immunol. 154: 3961-3968), pero no se ha demostrado para antígenos asociados con la mayoría de tumores sólidos, leucemias o linfomas.

Los experimentos de la presente invención, mostrados a continuación en el presente documento, describen el diseño y el análisis de un agonista del epítope de PSA-3 CTL, designado PSA-3A. Estos experimentos demuestran que cuando es comparado con el epítope nativo de PSA-3, el epítope PSA-3A exhibió una unión mejorada al alelo MHC A2 de clase I y tuvo como resultado una estabilidad mejorada del complejo péptido MHC. Como se muestra en el presente documento, las líneas celulares T generadas bien con el péptido de PSA-3 o con el de PSA-3A mostraron niveles más elevados de lisis de objetivos pulsados con el péptido de PSA-3A que aquellos objetivos pulsados con el péptido de PSA-3. Esto se observó tanto cuando se titró la relación de concentración del péptido como del efector con respecto a las células objetivo.

Además, los experimentos de la presente invención muestran que las células T estimuladas con células dendríticas (DC) pulsadas con péptido de PSA-3A produjeron niveles más elevados de IFN-? que DC pulsadas con péptido de PSA-3. Sin embargo, no se observó ningún aumento en la apoptosis en las células T estimuladas con el agonista de PSA-3A cuando se comparó con las estimuladas con PSA-3. Notablemente, las líneas celulares T humanas generadas con el agonista de PSA-3A tienen la capacidad para lisar células humanas de carcinoma de próstata que expresan PSA nativo de forma restringida a MHC-A2.

Conforme a la presente invención, se construyeron virus vaccinia recombinantes que contenían el transgén completo de PSA con o sin el único cambio de aminoácido que constituye el epítope de PSA-3A. Las DC infectadas con el vector recombinante que contiene el cambio agonista de aminoácido dentro del gen completo de PSA (designado rV-PSA-3A) fueron más efectivas que el vector rV-PSA para mejorar la producción de IFN-? por las células T. Además, se...

1. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada entre:

2. Un vector que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. El vector de la reivindicación 2, en el que el vector es un vector de levadura.

4. El vector de la reivindicación 2, en el que el vector es un vector vírico seleccionado del grupo constituido por poxvirus, retrovirus, adenovirus, virus del herpes, virus de la polio, alfavirus, baculovirus y virus Sindbis.

5. El vector de la reivindicación 4, en el que el vector es un vector poxviral seleccionado del grupo constituido por el virus de la ortoviruela, el virus vaccinia, el virus de la viruela de las aves, el virus de la viruela de las aves de corral, el virus de la viruela caprina y ovina y el virus de la viruela porcina.

6. Una célula anfitriona que comprende un vector de cualquiera de las reivindicaciones 2-5.

7. La célula anfitriona de la reivindicación 6, en la que la célula anfitriona es humana.

8. La célula anfitriona de la reivindicación 6 o 7, en la que la célula anfitriona es una célula que presenta antígeno o una célula tumoral.

9. Un cebador que comprende una molécula de ácido nucleico aislado de la reivindicación 1.

10. Una sonda que comprende una molécula de ácido nucleico aislado de la reivindicación 1.

11. Una secuencia de aminoácidos aislados que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo constituido por VLSNDVCAQV (ID de SEC nº: 3), YISNDVCAQV (ID de SEC nº: 4) e YLSNDVCAQV (ID de SEC nº: 5).

12. Una secuencia de aminoácidos aislados que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por la ID de SEC nº: 26, la ID de SEC nº: 28 y la ID de SEC nº: 30.

13. Un kit para detectar una molécula de ácido nucleico que comprende: (a) una sonda de la reivindicación 10; y (b) al menos un componente para detectar la unión de la sonda a un ácido nucleico.

14. Un procedimiento para detectar un ácido nucleico que comprende: (a) incubar una sonda de la reivindicación 10 con una muestra biológica que comprende ácidos nucleicos, formando de ese modo un complejo de hibridación; y (b) detectar el complejo formado en (a), en el que la presencia del complejo indica la detección de un ácido nucleico.

15. Un procedimiento para producir de forma recombinante un péptido, que comprende: (a) cultivar una célula anfitriona de cualquiera de las reivindicaciones 6-8 bajo condiciones adecuadas para la producción de un péptido; y (b) recuperar el péptido de la célula anfitriona o del cultivo de la célula anfitriona, produciendo de ese modo el péptido.

16. Un procedimiento in vitro para identificar un agente que mejora la actividad del péptido agonista del antígeno específico de la próstata, que comprende: (a) incubar una célula T citotóxica con una secuencia de aminoácidos aislados de la reivindicación 11 o 12 y un agente de prueba; y (b) explorar en busca de la expansión de las células T citotóxicas, en el que la expansión indica la identificación de un agente para potenciar la actividad del péptido agonista del antígeno específico de la próstata.

17. Un procedimiento para identificar un agente para potenciar la actividad del péptido agonista del antígeno específico de la próstata, que comprende: (a) incubar una célula anfitriona de cualquiera de las reivindicaciones 6-8 con un agente de prueba, y (b) explorar en busca de la expansión de las células anfitrionas, en el que la expansión indica la identificación de un agente para potenciar la actividad del péptido agonista del antígeno específico de la próstata.

18. Una composición farmacéutica que comprende:

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 18 para su uso en el tratamiento o en la prevención del cáncer de próstata.

20. La composición de la reivindicación 19, en la que el medicamento es para su uso en la administración conjunta con un adyuvante seleccionado del grupo constituido por alumbre, sales de aluminio, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, sílice de aluminio, Montanide y fosfato cálcico.

21. La composición de la reivindicación 19, en la que el medicamento es para su uso en la administración conjunta con un adyuvante biológico seleccionado del grupo constituido por IL-2, IL-6, IL-12, RANTES, GM-CSF, TNF-a, INF-?, GM-CSF, G-CSF, ICAM-1, LFA-3, CD72, B7-1, BT-2, OX-40L y 41 BBL.

22. La composición de la reivindicación 19, en la que el medicamento es para su uso en la administración conjunta con una célula que presenta antígeno.

23. La composición de la reivindicación 19, en la que el medicamento es para su uso en la administración conjunta con una célula dendrítica o con una célula B.

24. La composición de la reivindicación 19, en la que el medicamento es para su uso en la administración en conjunto con una terapia seleccionada del grupo constituido por terapia hormonal, quimioterapia, cirugía, criocirugía, terapia de radiación, braquiterapia intersticial e inmunoterapia anti-HER2.

25. Una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los componentes seleccionados del grupo constituido por (a) un vector que comprende un ácido nucleico aislado que codifica al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por VLSNDVCAQV (ID de SEC nº: 3), YISNDVCAQV (ID de SEC nº: 4) e YLSNDVCAQV (ID de SEC nº: 5) bien solo o bien como parte de una secuencia completa de gen PSA o de porciones biológicamente activas del mismo; (b) una célula anfitriona que comprende el vector de (a); y (c) una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo constituido por VLSNDVCAQV (ID de SEC nº: 3), YISNDVCAQV (ID de SEC nº: 4) e YLSNDVCAQV (ID de SEC nº 5), para su uso en el tratamiento o en la prevención del cáncer de próstata.

26. Un procedimiento para monitorizar un procedimiento de tratamiento del cáncer de próstata, que comprende: (a) incubar una muestra biológica de un sujeto con un ácido nucleico aislado que codifica al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por VLSNDVCAQV (ID de SEC nº: 3), YISNDVCAQV (ID de SEC nº: 4) e YLSNDVCAQV (ID de SEC nº: 5), bajo condiciones que permitan que el ácido nucleico aislado se hibride con un ácido nucleico en la muestra para formar un híbrido; y (b) medir los niveles del híbrido formado en (a), monitorizando de ese modo el procedimiento del tratamiento.

27. Un aptámero de una secuencia de aminoácidos aislados que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo constituido por VLSNDVCAQV (ID de SEC nº: 3), YISNDVCAQV (ID de SEC nº: 4) e YLSNDVCAQV (ID de SEC nº: 5).