PROTEINAS DE RETINAL TRANSLOCADORAS DE PROTONES CON CONTENIDO DE TODO-TRANS-RETINAL CONSTANTE Y FOTOCICLO RETARDADO.

Composición fotocrómica que contiene al menos una proteína de retinal translocadora de protones seleccionada del grupo de:

(i) Muteínas de una proteína de retinal translocadora de protones natural de arqueobacterias halófilas que presentan un fotociclo retardado (mutación de tipo 1) y cuyo contenido de todo-trans-retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencia entre sí más del 10% (mutación de tipo 2) y/o

(ii) Homólogos de las muteínas (i) con fotociclo retardado cuyo contenido de todo-trans-retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad no se diferencia entre sí más del 10%,

que contiene además uno o varios aditivos seleccionados de estabilizadores, aditivos que reducen la formación de espuma y aditivos absorbentes de luz UV

Proteínas de retinal translocadoras de protones con contenido de todo-trans-retinal constante y fotociclo retardado.

La invención se refiere a una proteína de retinal translocadora de protones, a una composición fotocrómica que contiene la proteína de retinal translocadora de protones y al uso de la proteína de retinal translocadora de protones y de la composición.

Las halobacterias son arqueas que, además de las bacterias y los eucariotas, forman un tercer dominio de la vida. Las arqueas deben su nombre a los biotopos poco comunes en los que se presentan. Frecuentemente viven en condiciones "arcaicas", es decir, a temperaturas, concentraciones de sales o valores de pH extremos como pudieron haber predominado sobre la antigua superficie terrestre.

Las arqueas halófilas comprenden 9 géneros (por ejemplo, Halobacterium, Haloferax, Natronomonas, etc.) y son en su totalidad extremófilas, es decir, viven en disoluciones salinas cuya concentración va de 2 molar hasta la saturación y que algunas veces todavía presentan adicionalmente valores de pH alcalinos de hasta pH 11. En la naturaleza, las halobacterias son parte de un complejo sistema ecológico. La creciente salinidad con radiación solar permanente en plantas productoras de sal o las condiciones en el Mar Muerto y otras aguas hipersalinas naturales permiten en principio después de los aguaceros anuales el crecimiento fotolitótrofo de la alga verde halotolerante Duniella parva hasta un contenido de sal de aproximadamente el 12%. Después de superar las condiciones óptimas para ella, la Duniella muere y hace posible el crecimiento masivo de arqueas halófilas que, debido a su contenido de carotinoides, frecuentemente conducen a una coloración rojiza de estas aguas.

Las arqueas halófilas poseen, además de la fermentación, respiración aerobia y anaerobia, una posibilidad adicional de transformación de energía que es extraordinaria entre las arqueas: pueden captar y convertir energía mediante fotosíntesis dependiente de retinal. A diferencia de la fotosíntesis verde dependiente de la clorofila, en la captación y transformación de energía sólo participa una única proteína, concretamente una proteína de retinal translocadora de protones impulsada por la luz.

El ejemplo más conocido de una proteína de retinal translocadora de protones es la bomba de protones arqueobacteriana bacteriorodopsina (BR) que aprovecha la energía de la luz directamente para producir un gradiente de protones electroquímico que se transforma en energía química. La bacteriorodopsina es una proteína de la membrana intrínseca con un peso molecular de aproximadamente 26 kDa. La cadena de polipéptidos atraviesa la membrana siete veces y así forma una estructura secundaria de siete regiones transmembrana helicoidales. Un retinal (aldehído de vitamina A) está covalentemente unido a la cadena lateral de una lisina de la séptima hélice en el interior de la proteína. El grupo CH=N formado se llama base de Schiff (SB) y en el estado de partida está protonado en el nitrógeno (SBH). El trabajo de Haupts y col. (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28, 367-99, 1999) da una visión general sobre la bacteriorodopsina.

El cromóforo de BR absorbe luz verde amarillenta como máximo a 570 nm de manera que la BR parece violeta para el ojo humano. Después de la absorción de un protón, la proteína experimenta cambios químicos y estructurales que conducen a productos intermedios diferenciables espectroscópicamente medibles. Se denominan con las letras K, L, M, N y O y se indican respectivamente con la longitud de onda de la absorción máxima. El ciclo puede describirse simplificadamente de la siguiente manera:

BR₅₇₀ rightarrow K₅₉₀ rightarrow L₅₅₀ rightarrow M₄₁₀ rightarrow N₅₆₀ rightarrow O₆₄₀ rightarrow BR₅₇₀

La bacteriorodopsina es hasta la fecha la única proteína de retinal que se presenta en la naturaleza en forma de un cristal bidimensional. En la bacteria, los cristales están localizados en la llamada membrana púrpura. La organización en la membrana púrpura estabiliza la proteína hasta tal punto que ha sido propuesta para una serie de aplicaciones industriales (resumido en Oesterhelt y col., Quarterly Rev. Biophysics 24, 425-478, 1991). A este respecto pueden aprovecharse los cambios que se producen con la iluminación del valor de pH de la disolución, de la tensión eléctrica y del color.

Por tanto, el cambio de color del violeta de la bacteriorodopsina en el estado inicial BR570 al amarillo en el producto intermedio M₄₁₀ es la base para aplicaciones en la tecnología de la información óptica. La descomposición del producto intermedio M₄₁₀ que tiene una vida media de pocos milisegundos es la etapa determinante de la velocidad en este ciclo. La intensidad de la luz y la constante de descomposición térmica del producto intermedio M determinan en el fotociclo la relación de los colores violeta y amarillo.

La parte de retinilideno de la bacteriorodopsina está presente en la oscuridad como una mezcla de configuraciones todo-trans, 15-anti y 13-cis, 15-sin en la relación de aproximadamente 60:40. Sólo la forma todo-trans del cromóforo media en el proceso fisiológico de la translocación de protones y pasa por el producto intermedio amarillo M₄₁₀ ("ciclo trans"). Aunque la absorción de protones en la configuración 13-cis también conduce a un ciclo de cambios de color, el "ciclo cis", sin embargo éste se diferencia del "ciclo trans" en que no se forma ningún producto intermedio amarillo similar a M. Del "ciclo cis" la molécula salta con iluminación con una probabilidad muy pequeña al "ciclo trans". Este cambio del "ciclo cis" al "trans" se denomina adaptación a la claridad de la forma adaptada a la oscuridad. En la práctica esto significa que después de guardar en la oscuridad una muestra (adaptación a la oscuridad), una iluminación inicial sólo conduce a aproximadamente el 60% del producto intermedio M teórico. Mediante otra iluminación, la muestra se adapta poco a poco (adaptación a la claridad) de manera que finalmente todas las moléculas se transfieren al "ciclo trans" y pasan por el producto intermedio M.

El cambio de las moléculas del "ciclo cis" al "trans" conduce a un desplazamiento de varios nm del máximo de absorción y significa una desventaja considerable para el uso de bacteriorodopsinas durante la preparación de productos fotocrómicos, por ejemplo, películas ópticas o tintas de impresión.

Por tanto, sería deseable preparar proteínas de retinal translocadoras de protones cuyo máximo de absorción en estado adaptado a la oscuridad se correspondiera a ser posible de forma exacta al estado adaptado a la claridad. Además, sería ventajoso si pudiera aumentarse la estabilidad del producto intermedio M para poder observar a ser posible de forma exacta el cambio de color de violeta a amarillo de las moléculas presentes en el "ciclo trans".

Según la invención, ahora se proporciona una proteína de retinal translocadora de protones que se selecciona del grupo de:

Por una muteína se entiende proteínas de retinal translocadoras de protones modificadas por una sustitución, deleción o inserción. Las muteínas pueden presentar una o varias mutaciones. Las mutaciones de tipo 1 son a este respecto mutaciones que conducen a un retardo del fotociclo en comparación con la proteína de retinal natural de Halobacterium salinarum (SEC ID No.1). La medición del fotociclo se realiza a este respecto como se describe, por ejemplo, por Miller & Oesterhelt, Biochem. Biophys. Acta 1020, 57-64, 1990. Las mutaciones de tipo 2 conducen a una elevada constancia en comparación con la proteína de retinal natural de Halobacterium salinarum (SEC ID No.1) del contenido de todo-trans-retinal...

1. Composición fotocrómica que contiene al menos una proteína de retinal translocadora de protones seleccionada del grupo de:

que contiene además uno o varios aditivos seleccionados de estabilizadores, aditivos que reducen la formación de espuma y aditivos absorbentes de luz UV.

2. Composición fotocrómica según la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína de retinal translocadora de protones presenta una composición de isómeros de retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad de al menos el 60% de todo-trans-retinal.

3. Composición fotocrómica según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la proteína de retinal translocadora de protones natural es una rodopsina arqueobacteriana.

4. Composición fotocrómica según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la rodopsina arqueobacteriana es una rodopsina de halobacterias.

5. Composición fotocrómica según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la rodopsina arqueobacteriana es bacteriorodopsina (SEC ID No.1) de Halobacterium salinarum.

6. Composición fotocrómica según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el homólogo presenta una secuencia de aminoácidos que presenta al menos el 40% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID No.1.

7. Composición fotocrómica según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el homólogo presenta una secuencia de aminoácidos que en el intervalo de la hélice C y/o F presenta al menos el 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID No.1.

8. Composición fotocrómica según al menos una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el fotociclo de las muteínas con una mutación de tipo 1 presenta un tiempo de ciclo térmico de más de 10 ms.

9. Composición fotocrómica según al menos una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque la mutación de tipo 1 es un intercambio de aminoácidos en una o varias de las posiciones de aminoácidos que en la proteína natural participan en el ciclo catalítico.

10. Composición fotocrómica según la reivindicación 9, caracterizada porque los aminoácidos que participan en el ciclo catalítico se seleccionan del grupo que comprende los restos de aminoácidos D38, R82, D85, D96, D102, D104, E194 y/o E204.

11. Composición fotocrómica según al menos una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque la mutación de tipo 2 es un intercambio de aminoácidos en una o varias de las posiciones de aminoácidos que forman la bolsa de unión a retinal.

12. Composición fotocrómica según la reivindicación 11, caracterizada porque los aminoácidos que forman las bolsas de unión a retinal se seleccionan del grupo que comprende los restos de aminoácidos Val49, Ala53, L93, Met118, Gly122, S141 y Met145.

13. Composición fotocrómica según una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque es una muteína de la bacteriorodopsina de Halobacterium salinarum (SEC ID No.1) con mutaciones seleccionadas del siguiente grupo:

V49A-D96N; L93A-D96N; M145F-D96N

o un homólogo de una muteína tal.

14. Composición fotocrómica según al menos una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque la proteína de retinal se presenta en forma de una membrana púrpura.

15. Composición fotocrómica según la reivindicación 14, caracterizada porque la densidad de la membrana púrpura asciende a entre 1,10 y 1,20 g/cm³.

16. Composición fotocrómica según la reivindicación 15, caracterizada porque la densidad de la membrana púrpura asciende a 1,175 a 1,185 g/cm³.

17. Composición fotocrómica según una de las reivindicaciones 1-16, caracterizada porque están contenidos glicerol, polímeros orgánicos y/o disolventes orgánicos.

18. Uso de una proteína de retinal translocadora de protones seleccionada del grupo de:

y/o una composición fotocrómica según una de las reivindicaciones 1-17 para preparar películas ópticas.

19. Uso según la reivindicación 18, caracterizado porque la película óptica es adecuada para la grabación óptica.

20. Uso según la reivindicación 18, caracterizado porque la película óptica es adecuada para la interferometría.

21. Uso según la reivindicación 18, caracterizado porque la película óptica es adecuada para el reconocimiento holográfico de patrones.

22. Uso según la reivindicación 18, caracterizado porque la película óptica es adecuada como modulador óptico de la luz.

23. Uso de una proteína de retinal translocadora de protones seleccionada del grupo de:

para preparar memorias de gran volumen para el almacenamiento óptico de datos.

24. Uso de una proteína de retinal translocadora de protones seleccionada del grupo de:

o una composición fotocrómica según al menos una de las reivindicaciones 1 -20 como colorante de seguridad.

25. Uso según la reivindicación 24, caracterizado porque la proteína de retinal translocadora de protones y/o la composición fotocrómica se aplica sobre un documento que requiere seguridad o un objeto que requiere seguridad.

26. Uso según la reivindicación 25, caracterizado porque la proteína de retinal translocadora de protones y/o la composición fotocrómica aplicada sobre el documento que requiere seguridad se fija sobre el documento o el objeto.

27. Uso según la reivindicación 26, caracterizado porque la fijación se efectúa mediante inclusión física o acoplamiento covalente al documento o al objeto.

28. Uso según una de las reivindicaciones 25-27, caracterizado porque el documento que requiere seguridad es un papel de seguridad.

29. Uso según una de las reivindicaciones 25-27, caracterizado porque el documento que requiere seguridad es un carnet.

30. Uso según una de las reivindicaciones 25-27, caracterizado porque el documento que requiere seguridad es un billete de banco.

31. Uso según una de las reivindicaciones 18-30, caracterizado porque la proteína de retinal translocadora de protones presenta una composición de isómeros de retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad de al menos el 60% de todo-trans-retinal.

32. Uso según una de las reivindicaciones 18-31, caracterizado porque la proteína de retinal translocadora de protones natural es una rodopsina arqueobacteriana.

33. Uso según una de las reivindicaciones 18-32, caracterizado porque la rodopsina arqueobacteriana es una rodopsina de halobacterias.

34. Uso según una de las reivindicaciones 18-33, caracterizado porque la rodopsina arqueobacteriana es bacteriorodopsina (SEC ID No. 1) de Halobacterium salinarum.

35. Uso según una de las reivindicaciones 18-34, caracterizado porque el homólogo presenta una secuencia de aminoácidos que presenta al menos el 40% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID No.1.

36. Uso según una de las reivindicaciones 18-35, caracterizado porque el homólogo presenta una secuencia de aminoácidos que en el intervalo de la hélice C y/o F presenta al menos el 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID No.1.

37. Uso según una de las reivindicaciones 18-36, caracterizado porque el fotociclo de las muteínas con una mutación de tipo 1 presenta un tiempo de ciclo térmico de más de 10 ms.

38. Uso según una de las reivindicaciones 18-37, caracterizado porque la mutación de tipo 1 es un intercambio de aminoácidos en una o varias de las posiciones de aminoácidos que en la proteína natural participan en el ciclo catalítico.

39. Uso según la reivindicación 38, caracterizado porque los aminoácidos que participan en el ciclo catalítico se seleccionan del grupo que comprende los restos de aminoácido D38, R82, D85, D96, D102, D104, E194 y/o E204.

40. Uso según una de las reivindicaciones 18-39, caracterizado porque la mutación de tipo 2 es un intercambio de aminoácidos en una o varias de las posiciones de aminoácidos que forman la bolsa de unión a retinal.

41. Uso según la reivindicación 40, caracterizado porque los aminoácidos que forman las bolsas de unión a retinal se seleccionan del grupo que comprende los restos de aminoácidos Val49, Ala53, L93, Met118, Gly122, S141 y Met145.

42. Uso según una de las reivindicaciones 18-41, caracterizado porque es una muteína de bacteriorodopsina de Halobacterium salinarum (SEC 1 D No. 1) con mutaciones seleccionadas del siguiente grupo:

V49A-D96N; L93A-D96N; M145F-D96N

o un homólogo de una muteína tal.

43. Uso según al menos una de las reivindicaciones 18-42, caracterizado porque la proteína de retinal se presenta en forma de una membrana púrpura.

44. Uso según la reivindicación 43, caracterizado porque la densidad de la membrana púrpura asciende a entre 1,10 y 1,20 g/cm³.

45. Uso según la reivindicación 44, caracterizado porque la densidad de la membrana púrpura asciende a 1,175 a 1,185 g/cm³.

46. Procedimiento para preparar documentos con característica de seguridad, caracterizado porque antes, durante o después de la preparación de un documento se aplica de forma habitual una proteína de retinal translocadora de protones seleccionada del grupo de:

o una composición fotocrómica según una de las reivindicaciones 1-17 y dado el caso se fija.

47. Procedimiento según la reivindicación 46, caracterizado porque la proteína de retinal translocadora de protones presenta una composición de isómeros de retinal en estado adaptado a la claridad y a la oscuridad de al menos el 60% de todo-trans-retinal.

48. Procedimiento según la reivindicación 46 ó 47, caracterizado porque la proteína de retinal translocadora de protones natural es una rodopsina arqueobacteriana.

49. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-48, caracterizado porque la rodopsina arqueobacteriana es una rodopsina de halobacterias.

50. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-49, caracterizado porque la rodopsina arqueobacteriana es bacteriorodopsina (SEC ID No.1) de Halobacterium salinarum.

51. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-50, caracterizado porque el homólogo presenta una secuencia de aminoácidos que presenta al menos el 40% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID No.1.

52. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-51, caracterizado porque el homólogo presenta una secuencia de aminoácidos que en el intervalo de la hélice C y/o F presenta al menos el 60% de identidad con la secuencia de aminoácidos SEC ID No.1.

53. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-52, caracterizado porque el fotociclo de las muteínas con una mutación de tipo 1 presenta un tiempo de ciclo térmico de más de 10 ms.

54. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-53, caracterizado porque la mutación de tipo 1 es un intercambio de aminoácidos en una o varias de las posiciones de aminoácidos que participan en la proteína natural en el ciclo catalítico.

55. Procedimiento según la reivindicación 54, caracterizado porque los aminoácidos que participan en el ciclo catalítico se seleccionan del grupo que comprende los restos de aminoácidos D38, R82, D85, D96, D102, D104, E194 y/o E204.

56. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-55, caracterizado porque la mutación de tipo 2 es un intercambio de aminoácidos en una o varias de las posiciones de aminoácidos que forman la bolsa de unión a retinal.

57. Procedimiento según la reivindicación 56, caracterizado porque los aminoácidos que forman las bolsas de unión a retinal se seleccionan del grupo que comprende los restos de aminoácidos Val49, Ala53, L93, Met118, Gly122, S141 y Met145.

58. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-57, caracterizado porque es una muteína de bacteriorodopsina de Halobacterium salinarum (SEC 1 D No.1) con mutaciones seleccionadas del siguiente grupo:

V49A-D96N; L93A-D96N; M145F-D96N

o un homólogo de una muteína tal.

59. Procedimiento según una de las reivindicaciones 46-58, caracterizado porque la proteína de retinal se presenta en forma de una membrana púrpura.

60. Procedimiento según la reivindicación 59, caracterizado porque la densidad de la membrana púrpura asciende a entre 1,10 y 1,20 g/cm³.

61. Procedimiento según la reivindicación 60, caracterizado porque la densidad de la membrana púrpura asciende a 1,175 a 1,185 g/cm³.

62. Composición fotocrómica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -17 en la que como otro aditivo están contenidas sustancias tampón.