PROTEINAS DE FUSION DE P53 SIN ACTIVIDAD DE TRANSCRIPCION Y SUS APLICACIONES.

Las proteínas de fusión están basadas en la proteína p53, comprenden un dominio de unión a Mdm2 y/o un dominio de ubiquitilación,

y carecen de la totalidad o parte del dominio responsable de la unión al ADN de dicha proteína p53, el cual ha sido reemplazado, total o parcialmente, por un péptido etiqueta; por tanto, dichas proteínas de fusión carecen de la actividad de transcripción de las proteínas p53. De aplicación en el cribado de compuestos que inhiben la degradación de la proteína p53 vía Mdm2 y/o vía proteasoma

Proteínas de fusión de p53 sin actividad de transcripción y sus aplicaciones.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de una proteína p53 nativa en la que el dominio responsable de la unión al ADN de dicha proteína p53 ha sido reemplazado, prácticamente en su totalidad, por un péptido etiqueta y, por tanto, carece de la actividad de transcripción de dicha proteína p53 nativa, y donde dicha proteína de fusión comprende un dominio de unión a Mdm2 y/o un dominio de ubiquitilación.

Antecedentes de la invención

La proteína p53 es una proteína que está presente en células eucariotas y desempeña una función fundamental en los mecanismos de respuesta celular frente al daño o mutación en el genoma, hecho por el que a principios de la década de los 90 recibió el sobrenombre de "guardián del genoma".

En general, se distinguen 3 dominios en una proteína p53, concretamente, un dominio amino-terminal, un dominio (central) de unión al ADN y un dominio carboxilo-terminal. A modo ilustrativo, la proteína p53 humana nativa, estructuralmente, está fonnada por 393 aminoácidos, los cuales pueden agruparse en tres dominios, tal como se muestra en la Figura 1 [Arrowsmith C.H. Structure and function in the p53 family. Cell Death Differ. 1999 Dec; 6(12):1169-73. Review].

Dominio amino-terminal

Comprende desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 112. Los primeros 54 residuos (1-54) constituyen el dominio de activación y poseen actividad transactivadora. Este dominio interacciona con la ARN polimerasa y aumenta la transcripción. Entre las proteínas que se unen a p53 en este dominio se encuentran la proteína E1b de adenovirus, la ligasa de ubiquitina Mdm2 (aminoácidos 17-29) y la proteína X del virus de la hepatitis B. En la región amino-terminal también se encuentra una región rica en prolina (aminoácidos 63-97) que presenta una elevada similaridad con las proteínas que unen SH3, que es necesaria para la apoptosis y que interacciona con proteínas celulares tales como c-abl. La región que comprende los aminoácidos 92-112 ha sido implicada en la degradación de p53 vía el proteasoma. La proteína Mdm2 inactiva a p53 de forma que promueve su degradación. Un péptido sintético con una secuencia de aminoácidos que corresponde a dicha secuencia de degradación de p53 suprime la degradación de p53 mediada por Mdm2. La inhibición de la degradación de p53 mediada por Mdm2 resulta en un incremento en los niveles de la proteína p53 en la célula y restablece o aumenta su función supresora tumoral.

Dominio de unión al ADN

Comprende del aminoácido 113 hasta el aminoácido 290. La región central es resistente a la acción de enzimas proteolíticas y, además, interacciona con el antígeno mayor del virus SV40. En este dominio se localizan cuatro regiones altamente conservadas entre diferentes especies y sirve de reconocimiento y de unión al ADN. Los residuos 248 y 273 (ambos Arg) son los que se unen directamente al ADN y, además, son los que sufren mayor número de mutaciones en muestras tumorales. Esta región posee el principal dominio de interacción con la ligasa de ubiquitina E6/E6-AP.

Dominio carboxilo-terminal

Comprende desde el aminoácido 291 hasta el aminoácido 393. La región carboxilo-terminal incluye una región de enlace y un dominio de oligomerización (aminoácidos 319-363). En esta zona se localizan 3 tipos de funciones: la secuencia de localización nuclear (NLS) que es bipartita (aminoácidos 305-306 y 319-321), el dominio de oligomerización (aminoácidos 319-363) y una diana de fosforilación para la CDK (kinasa dependiente de ciclina). Este dominio también contiene la secuencia de exportación nuclear (NES) (aminoácidos 339-352). Los mutantes en NES muestran una proteína p53 de localización exclusivamente citoplasmática. Este dominio también interviene en la promoción de la apoptosis, en la regulación de la transcripción y en el reconocimiento del daño de la doble cadena de ADN.

En condiciones normales, la vida media de p53, en general, es muy corta y, consecuentemente, los niveles de p53 en la célula son bajos. Sin embargo, en respuesta a daño en el ADN celular o a estrés celular, los niveles de p53 aumentan. Este aumento en los niveles de p53 lleva a la activación de la transcripción de un número de genes que conducen a la célula bien hacia una parada del ciclo celular o bien a la muerte por apoptosis celular si a la célula le resulta imposible subsanar el daño en el genoma. Por tanto, una función importante de p53 consiste en prevenir la proliferación incontrolada de las células dañadas y proteger al organismo del desarrollo de tumores evitando que las células hijas hereden alteraciones genómicas.

Una anormalidad (e.g., deleciones o mutaciones en el gen que codifica para la proteína p53) se correlaciona con el desarrollo de algunos tipos de cáncer y tumores malignos incluyendo tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer de hueso, cáncer de pulmón, etc. Asimismo, se han descrito aumentos en su forma nativa en patologías donde los procesos apoptóticos se encuentran incrementados. La pérdida de la función p53 puede producirse por la inactivación de esta proteína debido a mutaciones que modifiquen su capacidad de unión al ADN, por la pérdida de la capacidad de regulación de proteínas que controlan los niveles de p53, o por su actividad y exclusión nuclear que interfiere con su papel como factor de transcripción.

Los niveles proteicos de p53 registran un aumento rápido en respuesta a estímulos tales como el daño directo en el ADN, la depleción de nucleótidos, la hipoxia, el shock de calor, la exposición a monóxido de nitrógeno, la radiación gamma (?) y ultravioleta y la presencia de dímeros de ciclobutano piridina. En situaciones de estrés hay un incremento en la unión de p53 al ADN, y aumenta su actividad biológica. La actividad de p53 es regulada por medio de múltiples modificaciones post-traduccionales dentro de las que se encuentran fosforilaciones, acetilaciones, ubiquitilaciones, neddilaciones y sumoilaciones, que no sólo aumentan su vida media, sino que también regulan su actividad como factor de transcripción.

La regulación de p53 está basada en su recambio o "turn-over" estricto efectuado por la ligasa de ubiquitina Mdm2. El gen de Mdm2 codifica para una fosfoproteína (Mdm2) de 90 kDa que tiene actividad E3 ubiquitina proteína ligasa y es capaz de interaccionar con el extremo amino-terminal de p53 y, de esta manera, contribuye a la translocación de p53 desde el núcleo hacia el citoplasma donde se degradará. Esta vía adquiere importancia debido a que p53 es capaz de unirse y regular de forma positiva la transcripción del gen de Mdm2. Así, aumentos en los niveles de proteína p53 resultan en incrementos de Mdm2 que conducen a la proteólisis de p53. Mdm2 contribuye a mantener los bajos niveles de p53 en células que no se someten a estrés. En determinadas situaciones, la transcripción de Mdm2 se induce más tarde que otros genes diana de p53, lo que favorece la existencia de un intervalo de tiempo que permite a p53 ejercer su actividad antes de su degradación. El tráfico núcleo-citoplásmico de p53 es esencial para su degradación dependiente de Mdm2 y depende de las secuencias de exportación nuclear (NES) que se encuentran en las regiones amino y carboxilo-terminal de dicha proteína y de la secuencia de localización nuclear (NLS).

Corriente abajo (downstream) del sitio requerido para la unión con Mdm2, la región amino-terminal de p53 también contiene una señal de susceptibilidad proteolítica que ha sido implicada en la degradación dependiente del proteasoma. La vía mayoritaria de degradación de p53 es la ruta de la ubiquitina-26S proteasoma, si bien también se ha descrito que p53 puede hidrolizarse por miembros de la familia de las cisteín-proteasas, como las calpaínas. Aunque el sistema proteasomal se presenta tanto en el citoplasma como en el núcleo, la degradación de p53 tiene lugar principalmente en el citoplasma, por lo que se necesita un retorno de p53 desde el núcleo a este compartimento.

La pérdida de actividad de p53 predispone a las células a exponerse a adquirir mutaciones oncogénicas. La proteína p53 es responsable del mantenimiento de una proliferación y crecimiento celular ordenado así como de una diferenciación de células normales. Una mutación en este gen puede ser uno de los cambios genéticos más significativos que lleven a la transformación de las células normales en malignas.

Debido a la importancia de...

1. Una proteína de fusión, basada en una proteína p53, que comprende un péptido etiqueta, un dominio de unión a Mdm2 y/o un dominio de ubiquitilación de una proteína p53, y carece de la totalidad o parte del dominio de unión al ADN de dicha proteína p53, de manera que carece de la actividad de transcripción de dicha p53.

2. Proteína de fusión según la reivindicación 1, seleccionada entre:

- una proteína de fusión de fórmula (I)

(I)(M)_n-T-(U)_p

donde,

M es un péptido que comprende un dominio de unión a Mdm2;

T es un péptido etiqueta;

U es un péptido que comprende un dominio de ubiquitilación;

n es un número entero igual a 0 ó 1; y

p es un número entero igual a 0 ó 1,

con la condición de que la suma de n y p es mayor o igual a 1 (n + p = 1); y

- una proteína de fusión de fórmula (II)

(II)(U)_p-T-(M)_n

donde M, T, U, n y p tienen los significados previamente mencionados.

3. Proteína de fusión según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho péptido etiqueta comprende una cola de (poli)histidina, una cola de (poli)arginina, glutatión S-transferasa-tag, FLAG-tag, proteína de unión a maltona (MBP), estreptavidina, la secuencia diana de biotinilización BSP de la enzima bacteriana Bira, un epítopo de una etiqueta reconocido por un anticuerpo, una proteína fluorescente o una enzima.

4. Proteína de fusión según la reivindicación 3, en la que dicho péptido etiqueta se selecciona entre la proteína verde fluorescente (EGFP) y ß-galactosidasa.

5. Proteína de fusión según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho dominio de unión a Mdm2 (M) se selecciona entre:

        - vtcortaunauna secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos que se extiende desde el aminoácido 17 hasta el aminoácido 29 de la secuencia de aminoácidos de la proteína p53 humana nativa (SEQ ID NO: 56), o una variante funcionalmente equivalente de dicha secuencia de aminoácidos;

        - vtcortaunauna secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos que se extiende desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 32 de la secuencia de aminoácidos de la proteína p53 humana nativa (SEQ ID NO: 56), o una variante funcionalmente equivalente de dicha secuencia de aminoácidos;

        - vtcortaunauna secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos que se extiende desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 48 de la secuencia de aminoácidos de la proteína p53 humana nativa (SEQ ID NO: 56), o una variante funcionalmente equivalente de dicha secuencia de aminoácidos;

        - vtcortaunauna secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos que se extiende desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 83 de la secuencia de aminoácidos de la proteína p53 humana nativa (SEQ ID NO: 56), o una variante funcionalmente equivalente de dicha secuencia de aminoácidos; y

        - vtcortaunauna secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos que se extiende desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 118 de la secuencia de aminoácidos de la proteína p53 humana nativa (SEQ ID NO: 56), o una variante funcionalmente equivalente de dicha secuencia de aminoácidos.

6. Proteína de fusión según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho dominio de ubiquitilación se selecciona entre:

        - vtcortaunauna secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos que se extiende desde el aminoácido 361 hasta el aminoácido 393 de la secuencia de aminoácidos de la proteína p53 humana nativa (SEQ ID NO: 56), o una variante funcionalmente equivalente de dicha secuencia de aminoácidos;

        - vtcortaunauna secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos que se extiende desde el aminoácido 337 hasta el aminoácido 393 de la secuencia de aminoácidos de la proteína p53 humana nativa (SEQ ID NO: 56), o una variante funcionalmente equivalente de dicha secuencia de aminoácidos;

        - vtcortaunauna secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos que se extiende desde el aminoácido 324 hasta el aminoácido 393 de la secuencia de aminoácidos de la proteína p53 humana nativa (SEQ ID NO: 56), o una variante funcionalmente equivalente de dicha secuencia de aminoácidos;

        - vtcortaunauna secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos que se extiende desde el aminoácido 317 hasta el aminoácido 393 de la secuencia de aminoácidos de la proteína p53 humana nativa (SEQ ID NO: 56), o una variante funcionalmente equivalente de dicha secuencia de aminoácidos; y

        - vtcortaunauna secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos que se extiende desde el aminoácido 302 hasta el aminoácido 393 de la secuencia de aminoácidos de la proteína p53 humana nativa (SEQ ID NO: 56), o una variante funcionalmente equivalente de dicha secuencia de aminoácidos.

7. Proteína de fusión según la reivindicación 2, seleccionada entre una proteína de fusión de fórmula (I) en la que "n" es 1 y "p" es 0, una proteína de fusión de fórmula (I) en la que "p" es 1 y "n" es 0, y una proteína de fusión de fórmula (I) en la que "n" es 1 y "p" es 1.

8. Proteína de fusión según la reivindicación 2, seleccionada entre una proteína de fusión de fórmula (II) en la que "n" es 1 y "p" es 0, una proteína de fusión de fórmula (II) en la que "p" es 1 y "n" es 0, y una proteína de fusión de fórmula (II) en la que "n" es 1 y "p" es 1.

9. Proteína de fusión según la reivindicación 1, seleccionada entre las proteínas de fusión cuyas secuencias aminoacídicas son las identificadas como SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, y sus variantes funcionalmente equivalentes.

10. Un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Polinucleótido según la reivindicación 10, seleccionado entre los polinucleótidos cuyas secuencias nucleotídicas son las identificadas como SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 y SEQ ID NO: 44.

12. Un vector que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11.

13. Vector según la reivindicación 12, que comprende, además, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína Mdm2.

14. Una célula que comprende un vector según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13.

15. Célula según la reivindicación 14, seleccionada entre una célula de mamífero, una célula vegetal, una levadura y una bacteria.

16. Un procedimiento para la obtención de una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende cultivar una célula según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 bajo condiciones que promuevan la expresión de dicha proteína de fusión y, si se desea, aislar y, opcionalmente, purificar, dicha proteína de fusión.

17. Un método ex vivo para el cribado de compuestos que inhiben la degradación de la proteína p53 vía Mdm2 y/o vía proteasoma que comprende las etapas de:

        a)        transfectar una célula con un vector según la reivindicación 13, o, alternativamente, con un vector según la reivindicación 12 y con un segundo vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para Mdm2;

        b)        poner en contacto dicha célula transfectada con un compuesto a ensayar;

        c)        ensayar la capacidad de dicho compuesto de inhibir la degradación de la proteína p53; y

        d)        seleccionar el compuesto que presenta una capacidad inhibidora de la degradación de la proteína p53 ex vivo.

18. Método según la reivindicación 17, en el que dicha célula a transfectar es una célula que no expresa p53.

19. Método según la reivindicación 18, en el que dicha célula a transfectar es una célula "knock out" para el gen que codifica para dicha proteína p53.

20. Método según la reivindicación 19, en el que dicha célula a transfectar es una célula de cáncer de pulmón (H1299) o una célula de osteosarcoma (Saos-2) knock out para el gen que codifica para la proteína p53.