Un adenovirus que tiene un cápside que comprende una proteína hexon de adenovirus modificado,

comprendiendo dicha proteína hexon de adenovirus modificado una supresión en al menos una región hipervariable de una proteína hexon de adenovirus seleccionada a partir de la región 1 hipervariable y la región 4 hipervariable, y una secuencia exógena de aminoácido que comprende una secuencia de aminoácido inmunogénica insertada en la citada región 1 hipervariable y/o en la citada región 4 hipervariable, con la particularidad de que dicha secuencia exógena de aminoácido es distinta de una secuencia de adenovirus

Proteína hexon de adenovirus modificado y usos de la misma.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a proteínas hexon de adenovirus modificados, útiles en regímenes inmunogénicos.

El adenovirus es un virus de ADN de doble cadena con un tamaño de genoma de aproximadamente 36 kilobases (kb), que ha sido utilizando ampliamente para aplicaciones de transferencia genética debido a su capacidad para conseguir una transferencia genética de alta eficiencia en una diversidad de tejidos objetivo, y a su gran capacidad transgén. Convencionalmente, los genes E1 de adenovirus se suprimen y se reemplazan por un casete transgén que consiste en el promotor de elección, la secuencia cADN del gen de interés, y una señal poli A, lo que da como resultado un virus recombinante de replicación defectuosa.

Los adenovirus tienen una morfología característica con un cápside icosaédrico que consiste en tres proteínas principales, hexon (II), penton base (III) y una fibra abultada (IV), junto con un número de otras proteínas menores, VI, VII, IX, IIIa, y IVa2 [W.C. Russell, J. Gen. Virol., 81:2573-2604 (Nov. 2000)]. El genoma del virus es un ADN lineal, de doble cadena, con una proteína terminal sujeta de forma covalente a los terminales 5', que tienen repeticiones terminales invertidas (TRs). El ADN del virus está asociado íntimamente con la proteína VII altamente básica y con un pequeño péptido conocido como mu. Otra proteína, V, está empaquetada con este complejo de ADN-proteína, y proporciona un enlace estructural con el cápside a través de la proteína VI. El virus contiene también una proteína codificada de virus, la cual es necesaria para el procesamiento de algunas de las proteínas estructurales para producir virus infecciosos maduros.

Ya se ha descrito el uso de adenovirus para regímenes de vacuna y de suministro genético. Los adenovirus recombinantes han sido descritos para el suministro de moléculas a células huésped. Véase la Patente U.S. 6.083.716, la cual describe el genoma de dos adenovirus de chimpancés, C1 y C68 (Pan9). Véase también la Publicación de Patente Internacional núm. WO 02/33645, la cual describe vectores construidos a partir de los genomas de adenovirus de chimpancés SAd22/Pan5, Pan6, Pan7, así como también de adenovirus de simio SV1, SV25 y SV39; y la Publicación de Patente Internacional núm. WO 04/16614, la cual describe vectores de adenovirus híbridos y vectores construidos a partir del adenovirus de simio SA18.

Se ha propuesto con anterioridad una diversidad de modificaciones en los adenovirus. Tales modificaciones incluyen inserciones en la proteína de fibra del antivirus [Curiel, D.T., Ann N.Y. Acad. Sci., 886-158-71 (1999)]; inserciones en la proteína penton de fijación de objetivo [Einfield, D.A. et al.; J. Virol. 73:0130-6) (1999)]; inserciones en la proteína IX de adenovirus a efectos de fijación de objetivo [[Dmitriev, I.P. et al., (2002) J. Virol. 76:6893-9 (2002=]; y modificaciones de la hexon de adenovirus a efectos de fijación de objetivo [Vigne, E. et al., J. Virol. 73:5156-61 (1999); Solicitud de Patente Publicada U.S. núm. US2003143209 de Latta, Martine, et al.], así como para la inserción de un epítope antigénico.

Más en particular, la inserción de péptidos extraños en la proteína hexon del serotipo 2 de adenovirus humano (HAdV-2), ha sido descrita por Crompton et al., [(1994) J. Gen Virol. 75:133-9 (1964)]. Con referencia a la estructura del HAdV-2 informada por Roberts et al. [Roberts et al., (1986), Science. 232:1148-51], los autores sustituyeron 17 aminoácidos de la hexon del HAdV-2 (281-297) por 17 péptidos de aminoácido que hospedaban un determinante de poliovirus. La región de la hexon en la que se realizó esta sustitución, va a ser mencionada ahora como el bucle DE1 entre los elementos laminares beta ß₇ y ß₈ [Rux JJ, et al., (2003) J. Virol. 77:9553-66].

El trabajo de Crompton et al. (1994), fue reproducido por Vigne et al., citado anteriormente, en el serotipo 5 de adenovirus humano (HAdV-5), el cual pertenece al mismo subgrupo serológico que el HAdV-2, y está relacionado cercanamente con el mismo. Más en particular, Vigne et al., insertó péptidos en la hexon del HAdV-5, en una posición idéntica a la utilizada por Crompton et al. (en base a un alineamiento de proteína de la hexon de HAdV-2 con la hexon de HAdV-5). Vigne et al., sustituyó 14 residuos de hexon de HAdV-5 (269-281) por un péptido de poliovirus, así como un ligando de fijación de objetivo de la integrina.

Las regiones hipervariables de hexon de antivirus han sido descritas como regiones cuyas secuencias difieren considerablemente entre serotipos (Crawford-Miksza y Schnurr DP. El análisis de 15 proteínas hexon de adenovirus revela la localización y la estructura de siete regiones hipervariables que contienen residuos de serotipo específico, J. Virol. 1996, 70:1836-44; Rux et al., 2003).

El documento WO 2005/026337 describe un vector adenoviral dotado de un tropismo para células Car, y utilizado para transferencia de gen. El vector comprende al menos un área estructural débilmente manchada de una proteína de cápside, y un péptido heterólogo dotado de una unidad (W/R) X₁X₂D. El vector se utiliza para el tratamiento de cánceres, enfermedades musculares y mucoviscidosis.

Lo que se necesitan son métodos alternativos de suministro de moléculas a las células huésped.

Sumario de la invención

Según un aspecto, la invención proporciona un adenovirus que tiene un cápside que comprende una proteína hexon de adenovirus modificado, comprendiendo dicha proteína hexon de adenovirus modificado una supresión en al menos una región hipervariable de una proteína hexon de adenovirus, elegida a partir de la región 1 hipervariable y/o la región 4 hipervariable, y una secuencia de aminoácido exógeno que comprende una secuencia de aminoácido inmunogénico en la citada región hipervariable, con la provisión de que dicha secuencia de aminoácido exógeno es distinta de la secuencia de adenovirus.

Según otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de alteración de un vector de adenovirus, comprendiendo el procedimiento la etapa de proporcionar un adenovirus según se ha descrito en lo que antecede, comprendiendo la proteína hexon de adenovirus modificado de dicho adenovirus una secuencia de fijación de objetivo insertada en la supresión realizada en la región hipervariable.

La invención hace que resulte posible incrementar la respuesta inmune a una molécula inmunogénica suministrada por medio de un vector adenoviral mediante la provisión a un sujeto de un adenovirus que tiene un cápside con una proteína hexon de adenovirus modificado, según se ha descrito en lo que antecede, conteniendo además dicho adenovirus una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula inmune empaquetada en el cápside.

Todavía según otro aspecto, la invención proporciona una composición inmunogénica de auto-preparación que comprende un adenovirus que tiene un cápside que comprende una proteína hexon de adenovirus modificado, según se ha descrito anteriormente, en la que dicha secuencia de aminoácido exógeno es una primera secuencia de aminoácido; en la que dicho adenovirus comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda secuencia de aminoácido inmunogénico.

Otros aspectos y ventajas de la invención se pondrán más fácilmente de manifiesto a partir de la descripción detallada que sigue de la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un mapa del plásmido pNEBAsc, que resulta de la subclonación del genoma de tipo 5 del adenovirus humano (HAdV-5) que alberga la región de codificación de hexon en el plásmido pNEB 193 (adquirido en New England Biolabs);

La Figura 2A es un mapa del plásmido (p) SRAd5eGFP, el cual es un clon molecular de un vector de HAdV-5 suprimido en E1 y E3, que contiene la hexon de adenovirus natural y el gen marcador de proteína fluorescente verde;

La Figura 2B es un mapa del pH5sCD4eGFP, el cual es un clon de molécula de plásmido que contiene el esqueleto de HAdV-5, y de la hexon mutada que contiene el epítope CD4 de la proteína spike del coronavirus SARS;

La Figura 2C es un mapa del pH5sCD8eGFP, el cual es un clon de molécula de plásmido que contiene el genoma de HAdV-5 suprimido en E1 y E3, y de la hexon mutada que contiene...

1. Un adenovirus que tiene un cápside que comprende una proteína hexon de adenovirus modificado, comprendiendo dicha proteína hexon de adenovirus modificado una supresión en al menos una región hipervariable de una proteína hexon de adenovirus seleccionada a partir de la región 1 hipervariable y la región 4 hipervariable, y una secuencia exógena de aminoácido que comprende una secuencia de aminoácido inmunogénica insertada en la citada región 1 hipervariable y/o en la citada región 4 hipervariable, con la particularidad de que dicha secuencia exógena de aminoácido es distinta de una secuencia de adenovirus.

2. El adenovirus de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha proteína hexon comprende más de una supresión y/o una supresión parcial.

3. El adenovirus de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que la supresión comprende al menos 25 aminoácidos de la región hipervariable natural.

4. El adenovirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se mantienen al menos un aminoácido del terminal N y al menos un aminoácido del terminal C de la región hipervariable natural.

5. El adenovirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicha proteína hexon de adenovirus modificado comprende más de una secuencia exógena de aminoácido insertada en la misma.

6. El adenovirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la secuencia exógena de aminoácido comprende entre 5 y 45 residuos de aminoácido de longitud, o alrededor de 25 aminoácidos de longi-tud.

7. El adenovirus de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, en el que la secuencia exógena de aminoácido comprende una secuencia de fijación de objetivo.

8. El adenovirus de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la secuencia de fijación de objetivo se elige a partir del grupo consistente en un ligando para un receptor celular y un epítope para un anticuerpo o un fragmento del mismo.

9. El adenovirus de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la citada secuencia de fijación de objetivo se elige en el grupo consistente en un anticuerpo bi-específico, un Fab protuberante anti-fibra, y un anticuerpo anti-receptor.

10. El adenovirus de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha secuencia de aminoácido inmunogénica se elige en el grupo consistente en un epítope de célula T, un epítope de anticuerpo, y un antígeno de una proteína del HIV.

11. El adenovirus de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho epítope de célula T es un epítope de neutralización.

12. El adenovirus de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuencia de aminoácido procede de una proteína del HIV elegida a partir de al menos una proteína tat o una proteína envolvente.

13. El adenovirus de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la secuencia exógena de aminoácido es EQELLELDKWASLW, ID de SEQ núm. 12.

14. Un procedimiento de alteración de la especificidad de un vector de adenovirus, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de proporcionar un adenovirus de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo la proteína hexon de adenovirus modificado de dicho adenovirus una secuencia de fijación de objetivo insertada en la supresión de la región hipervariable.

15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que, una secuencia de aminoácido cargada positivamente, se inserta en el sitio de la supresión.

16. Uso de un adenovirus de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la preparación de un medicamento.

17. Una composición inmunogénica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

18. Una composición inmunogénica de auto-inicio, que comprende:

un adenovirus que tiene un cápside que comprende una proteína hexon de adenovirus modificado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia exógena de adenovirus es una primera secuencia de aminoácido inmunógeno;

en el que dicho adenovirus comprende además una secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda secuencia de aminoácido inmunogénica.

19. La composición inmunogénica de auto-inicio de acuerdo con la reivindicación 18, en la que dicha primera secuencia de aminoácido inmunogénica o antigénica, y dicha segunda secuencia de aminoácido inmunogénica o antigénica, son la misma.

20. La composición inmunogénica de auto-inicio de acuerdo con la reivindicación 18, en la que dicha primera secuencia de aminoácido inmunogénica o antigénica, y la citada segunda secuencia de aminoácido inmunogénica o antigénica, son diferentes e inducen una respuesta inmune respecto al mismo virus u organismo.

21. La composición inmunogénica de auto-inicio de acuerdo con la reivindicación 18, en la que dicha primera secuencia de aminoácido inmunogénica o antigénica, induce una respuesta inmune no-específica, y dicha segunda secuencia de aminoácido inmunogénica antigénica induce una respuesta inmune a un virus u organismo.

22. Uso de una composición inmunogénica de auto-inicio de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en la preparación de un medicamento.