PROTEINA DE RESISTENCIA AUTOACTIVADA.

Proteína de resistencia autoactivada para la producción de una resistencia contra patógenos en plantas,

caracterizada porque la proteína de resistencia es codificada por un ácido nucleico que presenta una parte limitada de un gen de resistencia NBS-LRR, que se extiende desde el extremo 5'' de la zona codificante del gen de resistencia NBS-LRR descendente hasta el inicio del dominio NBS del gen de resistencia NBS-LRR y no comprende ningún bucle P, no siendo el gen de resistencia NBS-LRR un gen de resistencia TIR-NBS-LRR

Proteína de resistencia autoactivada.

La presente invención se refiere a una proteína de resistencia autoactivada para la producción de una resistencia contra patógenos en plantas, a un procedimiento para la preparación de una planta transgénica, así como a plantas transgénicas.

Debido a las enfermedades de las plantas causadas por hongos, virus, nematodos y bacterias se producen en todo el mundo grandes pérdidas de cultivos, afecta a la calidad de los productos cultivados y hace necesario un empleo extendido de pesticidas químicos, porque las medidas defensivas naturales de las plantas, con cuya ayuda pueden combatir la mayoría de agentes patógenos potenciales o retardar y limitar su propagación, a menudo no son suficientes. A estas medidas defensivas pertenecen la reacción hipersensitiva, la muerte celular controlada del tejido huésped en el lugar de la infección, el refuerzo de la pared celular vegetal mediante lignificación y formación de calosa, la formación de fitoalexinas y la producción de proteínas PR (relacionadas con la patogénesis, del inglés patogénesis-related). Las moléculas clave para la activación de las medidas defensivas inducidas son los genes de resistencia vegetales (genes R). Según la hipótesis "gen por gen" de Flohrschen, la proteína de un gen R interacciona con la correspondiente proteína de un gen avirulencia microbiano (gen Avr) y desencadena de este modo la reacción defensiva inducida.

La mayoría de los genes R se pueden clasificar en 5 clases según la formación de la proteína R codificada por ellos (Martin et al, 2003). La clase 1 comprende sólo el gen Pto del tomate, que codifica para una serina/treonina quinasa. Sin embargo, la mayoría de los genes R vegetales pertenecen a la superfamilia de los genes NBS-LRR, que codifican para un "sitio de unión de nucleótidos" (NBS, del inglés "nucleotide binding site" y una "repetición rica en leucina" (LRR, del inglés "Leucine rich repeat"). Los genes NBS-LRR, que en su terminal N presentan una estructura de "super hélice" (CC, del inglés "coiled-coil"), como por ejemplo una "cremallera de leucina", se clasifican como genes CC-NBS-LRR de clase 2. Los genes R del tipo CC-NBS-LRR se encuentran en angiospermas extraños. En la clase 3 se encuentran los genes R del tipo TIR-NBS-LRR, que en el terminal N llevan una secuencia con homología con la región TIR (del inglés "toll-interleukin-1-receptor", receptor interleuquina-1/toll) animal, en lugar de un dominio CC. Los genes TIR-NBS-LRR representan un 75% de los genes R en Arabidopsis thaliana, aunque no se encuentran en céspedes y remolacha azucarera (Tian et al., 2004).

Los genes Cf forman la clase 4 de los genes R. Las proteínas CF no tienen ningún dominio NBS, pero tienen un dominio transmembrana (TM) y un LRR extracelular. A la clase 5 pertenece la proteína Xa21 del arroz, que está formada por un dominio LRR extracelular, un dominio transmembrana y un dominio de quinasas intracelulares.

Mientras que los genes R se expresan sólo débilmente a través de los promotores del gen R, una fuerte expresión constitutiva de los genes R de la clase 1, 2 y 3 conduce a una activación de la propia defensa contra patógenos vegetal en ausencia del correspondiente producto del gen avirulencia y por tanto conduce a la autoactivación de la proteína R (Tang et al., 1999; Oldroyd y Staskawicz, 1998; Bendahmane et al., 2002).

Sin embargo, en general la sobreexpresión constitutiva de los genes R en plantas transgénicas se relaciona con propiedades agronómicas indeseadas, como micronecrosis (Tang et al., 1999) o crecimiento reducido de las plantas (Frost et al., 2004).

Otra posibilidad de la autoactivación de proteínas R de clase 2 y 3 es la mutagénesis de motivos de aminoácido conservados especiales en las proteínas completas CC-NBS-LRR o TIR-NBS-LRR. La mutagénesis de secuencias en el dominio NBS o LRR del gen Rx de la patata (Bendahmane et al., 2002) y el dominio NBS del gen L6 del lino (Howles et al., 2005) conduce a mutantes, que en ausencia del correspondiente gen de avirulencia tras la expresión transitoria desencadenan la muerte celular.

Los experimentos de deleción con el gen Rx mostraron que los productos de deleción compuestos por el dominio CC y partes del dominio NBS tras su sobreexpresión transitoria también pueden desencadenar una muerte celular que se inicia más rápidamente que usando el gen R de longitud completa. Estos productos de deleción, además del dominio CC necesitan también el bucle P, la quinasa-2 y la quinasa-3a completa del dominio NBS. En cambio, otra reducción del dominio NBS conduciría a una activación HR más lenta en comparación con el gen R de longitud completa (Bendahmane et al. 2002).

Una autoactivación del gen L10 del lino, un gen R de clase 3, se podría conseguir mediante la formación de una proteína TIR-NBS-LRR reducida, que consta del dominio TIR y 34 aminoácidos del dominio NBS adyacente, incluido el bucle P (Frost et al., 2004).

Aunque se conocen varios métodos de autoactivación de genes R, hasta ahora no se han descrito plantas transgénicas en las cuáles la autoactivación de proteínas R conduzca a una elevada resistencia a los hongos sin perjudicar al mismo tiempo sus propiedades agronómicas. Los intentos de transformar de forma estable en el lino dos variantes autoactivadas de longitud completa del gen L6 bajo el control respectivo del promotor del gen de resistencia L6 nativo o un promotor inducido por hongos, condujeron a plantas de crecimiento normal sensibles a los hongos o bien a plantas de crecimiento reducido resistentes a los hongos (Howles et al., 2005).

Por consiguiente, es objetivo de la presente invención modificar la capacidad defensiva de una planta contra patógenos, de manera que las reacciones defensivas de la planta se activen de forma fiable en ataques patógenos, pero sin influir negativamente en las propiedades agronómicas de la planta.

Según la invención, se alcanza el objetivo propuesto mediante una proteína de resistencia autoactivada que es codificada por un ácido nucleico que presenta una parte limitada de un gen de resistencia NBS-LRR, que se extiende desde el extremo 5' de la zona codificante del gen de resistencia NBS-LRR de forma descendente hasta el inicio del dominio NBS del gen de resistencia NBS-LRR y no comprende ningún bucle P, no siendo el gen de resistencia NBS-LRR un gen de resistencia TIR-NBS-LRR.

La parte limitada del gen de resistencia NBS-LRR empieza por el codón de inicio para la translación (codón ATG) y llega hasta el dominio NBS, caracterizado fundamentalmente por el bucle P (motivo quinasa-1a). Para la función de esta parte del gen de resistencia NBS-LRR, no puede contener el bucle P. Tampoco deberían estar disponibles otras secciones del dominio NBS y del dominio LRR del gen de resistencia NBS-LRR. Por supuesto pueden permanecer nucleótidos individuales del dominio NBS incluido el bucle P, siempre que éstos no perjudiquen la activación de HR.

Se entiende por proteína de resistencia autoactivada una proteína tal, que en ausencia de un producto del gen de avirulencia correspondiente conduce a una activación de las defensas vegetales contra patógenos. Así, la invención tiene la ventaja que para la formación de una resistencia contra patógenos no es necesaria ninguna interacción entre una proteína de resistencia y una proteína de avirulencia, por lo que las reacciones defensivas de la planta pueden transcurrir esencialmente de forma más directa y finalmente de forma más fiable.

Una autoactivación se puede conseguir, por ejemplo, mediante una sobreexpresión transitoria del gen de resistencia. Sobreexpresión significa que se supera la fuerza de expresión del promotor natural del gen R hasta que se activa la cascasda de transducción de la señal regulada por la proteína R en ausencia del correspondiente producto del gen de avirulencia microbiano. Por consiguiente se produce la activación de la defensa contra patógenos que se traduce en una resistencia parcial o total a la enfermedad.

Sin embargo, se puede conseguir una autoactivación de la proteína de resistencia mediante la reducción de la longitud completa del gen R BvKWS3_165, BvKWS3_135, Bv13033 y Bv12069 de la remolacha azucarera, así como del gen StR3a de la patata en la zona 5', que sólo codifica para el terminal N libre de los dominios NBS y LRR de la proteína, incluido un eventual dominio CC. En este contexto, el terminal N libre del dominio NBS representa que el extremo 5' de la zona codificante...

1. Proteína de resistencia autoactivada para la producción de una resistencia contra patógenos en plantas, caracterizada porque la proteína de resistencia es codificada por un ácido nucleico que presenta una parte limitada de un gen de resistencia NBS-LRR, que se extiende desde el extremo 5' de la zona codificante del gen de resistencia NBS-LRR descendente hasta el inicio del dominio NBS del gen de resistencia NBS-LRR y no comprende ningún bucle P, no siendo el gen de resistencia NBS-LRR un gen de resistencia TIR-NBS-LRR.

2. Proteína de resistencia autoactivada según la reivindicación 1, que presenta una secuencia de aminoácidos con un motivo de secuencia DAE.

3. Proteína de resistencia autoactivada según la reivindicación 1, que presenta una secuencia de aminoácidos con un motivo de secuencia AV LXDAE.

4. Proteína de resistencia autoactivada según la reivindicación 1, caracterizada porque los ácidos nucleicos presentan una secuencia de nucleótidos del grupo siguiente:

5. Proteína de resistencia autoactivada según la reivindicación 1, caracterizada porque el gen de resistencia NBS-LRR es un gen de resistencia de remolacha azucarera o patata.

6. Proteína de resistencia autoactivada según la reivindicación 1, que presenta una secuencia de aminoácidos con una secuencia del grupo siguiente:

7. Planta transgénica con una proteína de resistencia autoactivada según una de las reivindicaciones anteriores.

8. Partes de una planta transgénica según la reivindicación 7.

9. Semilla transgénica o simiente transgénica con una proteína de resistencia autoactivada según una de las reivindicaciones 1 a 6.

10. Procedimiento para la preparación de una planta transgénica con resistencia incrementada contra patógenos, así como de semillas transgénicas o simientes transgénicas de una de tales plantas mediante el uso de ácidos nucleicos, en que los ácidos nucleicos codifican para una proteína de resistencia autoactivada y la parte limitada presenta un gen de resistencia NBS-LRR que se extiende desde el extremo 5' de la zona codificante del gen de resistencia NBS-LRR de forma descendente hasta el inicio del dominio NBS del gen de resistencia NBS-LRR y no comprende ningún bucle P, no siendo el gen de resistencia NBS-LRR un gen de resistencia TIR-NBS-LRR.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para una secuencia de aminoácidos con un motivo de secuencia DAE.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para una secuencia de aminoácidos con un motivo de secuencia AVLXDAE.

13. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico presenta una secuencia de nucleótidos del grupo siguiente:

14. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el gen de resistencia NBS-LRR se trata de un gen de remolacha azucarera o patata.

15. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para una secuencia de aminoácidos con una secuencia seleccionada del grupo siguiente:

16. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque emplea una construcción de ácidos nucleicos con

17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque el promotor inducible por patógenos es un promotor sintético.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque el promotor sintético comprende una o varias de las combinaciones de elementos cis siguientes, representando n y m un número natural de 1...10:

19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque la combinación de elementos cis comprende