PROTEINA CAPSIDIAL VP1 MODIFICADA DEL PARVOVIRUS B19.

Proteína capsidial VP1 modificada del parvovirus B19 que tiene una actividad enzimática de tipo fosfolipasa A2 reducida en comparación con la proteína capsidial VP1 de tipo silvestre del parvovirus B19 que tiene la secuencia de aminoácidos de la Sec ID Nº:

1, en la que uno o más de los restos aminoacídicos conservados en el centro activo de la fosfolipasa A2 se modifican en la posición 153: histidina; en la posición 157: tirosina; en la posición 162: lisina; y/o en la posición 168: tirosina

Proteína capsidial VP1 modificada del parvovirus B19.

La presente invención se refiere a proteínas y partículas capsidiales del parvovirus B19 modificadas, a sus usos y a la fabricación de medicamentos que incluyen vacunas para el tratamiento de enfermedades asociadas al parvovirus B19.

El parvovirus B19 se descubrió en 1975 como causante de infecciones sistémicas en adultos que eran asintomáticos o tenían síntomas leves no específicos tales como cefalea, pirexia, malestar, fatiga y mialgia (1, 2, 3). En 1984 el parvovirus B19 se identificó como el agente etiológico de eritema infeccioso, también conocidos como quinta enfermedad (4). El virus se extiende a nivel mundial pero se limita exclusivamente a huéspedes humanos. Con respecto a diferencias regionales aproximadamente del 40 al 60 por ciento de la población presenta anticuerpos contra proteínas virales a los 20 años. La infección es endémica, sin embargo alcanza brotes regionales al finalizar el invierno y en la primavera. El virus es muy estable. En general se transmite por vía oral desde individuos con infección aguda (5). Además de esta vía de infección principal el virus puede transmitirse por la sangre y productos derivados de la sangre por vía parenteral y verticalmente de la madre al feto (6, 7, 8, 9). La replicación productiva masiva del parvovirus B19 tiene lugar en las células progenitoras eritroides (10). Por lo tanto durante la infección aguda la carga viral es extremadamente alta y pueden presentarse hasta 10¹³ partículas y/o genomas virales por mililitro de sangre periférica. El virus se une a las células precursoras de eritrocitos usando el antígeno P del grupo sanguíneo (globósido) como el receptor celular para la adsorción (11). Se ha observado que después de la infección y la eliminación de la sangre periférica los genomas virales están presentes en las células de la médula ósea y en la piel, en las células sinoviales, en tejidos hepáticos y en el endotelio del miocardio (12, 13, 14, 15, 16, 17). Hasta ahora no está claro si estas células producen las proteínas virales y/o las partículas de B19 infecciosas y si el genoma viral puede reactivarse para la replicación productiva.

Habitualmente la infección por parvovirus B19 carece de síntomas clínicos o puede dar como resultado una enfermedad similar a la gripe. Particularmente los niños pueden padecen eritema infeccioso (quinta enfermedad), una enfermedad eruptiva autolimitada (18, 19, 20). También se ha relacionado el parvovirus B19 con un amplio espectro de enfermedades (Tabla 1): puede producirse anemia transitoria, leucocitopenia o trombocitopenia sin necesitar ninguna terapia. Sin embargo, en algunos pacientes se observó trombocitopenia grave, aplasia eritrocitaria pura o pancitopenia. Junto con estas secuelas hematológicas de hepatitis por infección aguda, también puede producirse ocasionalmente miocarditis, miositosis, lesión pulmonar aguda y enfermedades neurológicas (12, 21, 22, 23, 24). En gestantes, como manifestaciones clínicas, se ha descrito aborto espontáneo, hidrops fetal no inmune y muerte fetal intrauterina (25, 26). En gestantes no inmunes con infección aguda se ha observado un índice de mortalidad fetal de aproximadamente el 9% (9, 27). Sin embargo también hay estudios que describen un mayor porcentaje para el desarrollo de hidrops fetal en gestantes no inmunes infectadas por B19 (28). Dependiendo del estado hematológico del huésped; por ejemplo pacientes con anemia falciforme o talasemia, la infección por B19 da lugar a una crisis aplásica. La infección persistente por parvovirus B19 se ha descrito en pacientes con y sin inmunodeficiencias subyacentes (29, 30).

Además de estas manifestaciones generales la infección por parvovirus B19 puede inducir un amplio espectro de fenómenos autoinmunes. Las citopenias autoinmunes son trastornos hematológicos bien conocidos que pueden afectar a cualquier linaje celular de la médula ósea. En la inmensa mayoría de casos únicamente una de las líneas celulares se afecta. Sin embargo, se conoce la destrucción simultánea mediada autoinmune de granulocitos neutrófilos y trombocitos debido a la infección persistente por parvovirus B19 (31). El parvovirus B19 se ha identificado como un posible desencadenante en algunos casos de trombocitopenia inmune (32, 33, 34, 35). El espectro clínico de la artropatía autoinmune varía desde artralgias leves a vasculitis necrotizante severa (Tabla 1). En algunos brotes de eritema infeccioso, se han descrito generalmente artralgias y artritis. La infección por B19 puede producir una poli artropatía periférica simétrica en adultos. Normalmente los síntomas son autolimitantes pero pueden persistir durante algunos meses. Ocasionalmente, en pacientes con poliartralgia/poliartritis de larga duración se ha observado viremia combinada con anticuerpos IgM/IgG contra las proteínas VP1 y/o VP2 estructurales. Algunos de estos cumplieron con los criterios de la artritis reumatoide (AR) (26, 37). Sin embargo el desarrollo de AR después de infección aguda por parvovirus parece ser inusual (38, 39). En niños se conoce bien la relación de la infección por B19 con artritis-artralgias. Algunos de los niños afectados pueden desarrollar artritis crónica indistinguible de la artritis idiopática juvenil (40, 41, 42, 43). El espectro clínico incluye mono, oligo y poliartritis. Adicionalmente se observa frecuentemente viremia persistente en niños con artritis idiopática juvenil sistémica. En niños con diversas formas de artritis juvenil se amplificó ADN del B19 en el 57% del suero y/o del líquido sinovial de aquellos con infección previa por parvovirus B19. En muchos pacientes podría demostrarse la presencia continua de partículas virales e inmunocomplejos en la sangre periférica así como en el líquido sinovial (44). A pesar del desarrollo y de la presencia de inmunoreacción específica del B19 los niños no podían eliminar el virus y mostraron un estado de viremia prolongado o persistencia viral en el líquido sinovial.

La infección por parvovirus B19 se ha asociado con diversas formas de vasculitis, colagenosis y puede imitar al lupus eritematoso sistémico (LES) en niños y adultos (39, 45, 46). Similar a la situación en pacientes con artritis también se ha descrito en pacientes con LES infección por parvovirus B19 como agente causante o desencadenante de la enfermedad reumática (47, 48, 49, 50, 51). Recientemente, se describió una asociación entre la infección persistente por parvovirus B19 y la producción de anticuerpos anti-fosfolipídicos en pacientes pediátricos y adultos con enfermedades reumáticas (52). El síndrome anti fosfolipídico (SAF) (53) se caracteriza, al igual que algunas infecciones por parvovirus B19, por una amplia diversidad de manifestaciones hemocitopénicas y vaso-oclusivas. Adicionalmente la pérdida fetal recurrente y la asociación con anticuerpos dirigidos contra fosfolípidos cargados negativamente y cofactores de proteínas, principalmente ß2-glicoproteína-I son importantes características del SAF. La hipótesis con respecto a una patogenicidad común del síndrome anti-fosfolipídico y las características autoinmunitarias observadas en la infección por B19 no sólo se basa por la estrecha asociación entre la presencia de anticuerpos anti-fosfolipídicos y la infección por parvovirus B19 sino también por la similitud en la presentación de síntomas clínicos en pacientes con infección por parvovirus B19 y en pacientes con el síndrome anti fosfolipídico (SAF).

La cápside icosaédrica del parvovirus B19 comprende dos proteínas estructurales, VP1 (83 kDa) y VP2 (58 kDa), que son idénticas excepto en 227 aminoácidos (aa) en el extremo amino-terminal de la proteína VP1 (la región única de VP1).

En la secuencia de aminoácidos de la región única de VP1 está presente un motivo fosfolipasa A2 que abarca las posiciones 130 a 195 (centro activo Fosfolipasa A2) (54). Uno de los mecanismos patogénicos implicado en el desencadenamiento de la producción de anticuerpos anti-fosfolipídicos podría ser la actividad de tipo fosfolipasa-A2 observada en la región única de VP1 de la proteína estructural VP1 del parvovirus B19 (54). Esta actividad enzimática está presente en las partículas infecciosas del B19, en las cápsides vacías recombinantes constituidas por las proteínas VP1/VP2 y en preparaciones de la región única de VP1 purificada. Esto puede contribuir a los procesos inflamatorios inducidos por la producción de leucotrienos y prostaglandinas, pero también puede conducir a la generación de productos de escisión naturales inusuales a partir de compuestos fosfolipídicos celulares que pueden inducir anticuerpos aPL en combinación...

1. Proteína capsidial VP1 modificada del parvovirus B19 que tiene una actividad enzimática de tipo fosfolipasa A2 reducida en comparación con la proteína capsidial VP1 de tipo silvestre del parvovirus B19 que tiene la secuencia de aminoácidos de la Sec ID Nº: 1, en la que uno o más de los restos aminoacídicos conservados en el centro activo de la fosfolipasa A2 se modifican en la posición 153: histidina; en la posición 157: tirosina; en la posición 162: lisina; y/o en la posición 168: tirosina.

2. La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizada porque la histidina 153 se modifica a alanina.

3. La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizada porque la tirosina 157 se modifica a fenilalanina.

4. La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizada porque la lisina 162 se modifica a leucina.

5. La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizada porque la tirosina 168 se modifica a fenilalanina.

6. La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la sustitución de los restos aminoacídicos se realiza por mutagénesis dirigida.

7. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7.

9. Un vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 8 caracterizado porque adicionalmente comprende una proteína capsidial VP2 del parvovirus B19.

10. Un vector de expresión recombinante de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque la proteína capsidial VP1 modificada se fusiona con la proteína capsidial VP2.

11. Una célula huésped que comprende el vector de expresión recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

12. La célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11 que es E. coli, una levadura, preferentemente Saccharomyces cerevisiae o células animales.

13. Un procedimiento de producción de la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 de acuerdo con la reivindicación 10, usando la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que la proteína capsidial VP1 modificada y/o el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 están aislados y/o purificados.

15. La proteína capsidial VP1 modificada o el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 que pueden obtenerse usando el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14.

16. La proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 15, o el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 de acuerdo con la reivindicación 15 para su uso como medicamentos.

17. El uso de la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 15 y 16, con o sin proteína capsidial VP2 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento contra una infección por parvovirus B19 y/o enfermedades autoinmunes y reumáticas asociadas al parvovirus B19.

18. El uso del producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada y de la proteína capsidial VP2 de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento contra una infección por el parvovirus B19 y/o enfermedades autoinmunes y reumáticas asociadas al parvovirus B19.

19. El uso de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, caracterizado por que el tratamiento es contra artralgias; artritis; más preferentemente monoartritis, oligoartritis, poliartritis, artritis reumatoide y/o artritis idiopática juvenil; lupus eritematoso sistémico (LES); vasculitis, más preferentemente vasculitis leucocitoclástica, púrpura de Henlein-Schoenoch, síndrome papulopurpúrico en guantes y calcetines (SPPGC), enfermedad de Kawasaki, arteritis de células gigantes (ACG), poliarteritis nodosa y/o granulomatosis de Wegener; dermatomiositis; neutropenia autoinmune; trombocitopenia autoinmune; púrpura trombocitopénica idiopática (PTI); anemia hemolítica autoinmune; y/o síndrome hemofagocítico asociado a un virus (SHAV).

20. El uso de la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 15 y 16 o el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada y la proteína capsidial de VP2 de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16, en un ensayo para detectar anticuerpos dirigidos contra la proteína VP1 del virus B19 en una muestra a ensayar.

21. El uso de las células huésped de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12 en un ensayo para detectar anticuerpos dirigidos contra la proteína VP1 del virus B19 en una muestra a ensayar.

22. Partículas recombinantes similares a un virus constituidas por la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 ó 15 a 16 con o sin proteína capsidial VP2.

23. Partículas recombinantes similares a un virus constituidas por el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada y la proteína capsidial VP2 de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16.

24. El uso de las partículas recombinantes similares a un virus de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento contra la infección por parvovirus B19 y/o enfermedades autoinmunes y reumáticas asociadas al parvovirus B19.

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 24 caracterizado porque el tratamiento es contra tratamiento es contra artralgias; artritis; más preferentemente monoartritis, oligoartritis, poliartritis, artritis reumatoide y/o artritis idiopática juvenil; lupus eritematoso sistémico (LES); vasculitis, más preferentemente vasculitis leucocitoclástica, púrpura de Henlein-Schoenoch, síndrome papular purpúrico en guantes y calcetines (SPPGC), enfermedad de Kawasaki, arteritis de células gigantes (ACG), poliarteritis nodosa y/o granulomatosis de Wegener; dermatomiositis; neutropenia autoinmune; trombocitopenia autoinmune; púrpura trombocitopénica idiopática (PTI); anemia hemolítica autoinmune; y/o síndrome hemofagocítico asociado a virus (SHAV).

26. El uso de las partículas recombinantes similares a un virus de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23 en un ensayo para detectar anticuerpos dirigidos contra la proteína VP1 del virus B19 en una muestra a ensayar.

27. Una composición farmacéutica, especialmente una preparación de vacuna para inducir una respuesta inmune que proporciona protección contra el parvovirus humano B19, que comprende la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 15 y 16, con o sin la proteína capsidial VP2.

28. Una composición farmacéutica, especialmente una preparación de vacuna para inducir una respuesta inmune que proporciona protección contra el parvovirus humano B19, que comprende el producto de fusión de la proteína capsidial VP1 modificada de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16.

29. Una composición farmacéutica, especialmente una preparación de vacuna para inducir una respuesta inmune que proporciona protección contra el parvovirus humano B19, que comprende las partículas recombinantes similares a un virus de acuerdo con la reivindicación 22 ó 23.

30. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, que comprende adicionalmente uno o más transportadores y/o adyuvantes adecuados para los propósitos de vacunación.

31. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30, que comprende adicionalmente una sustancia inmunoestimuladora, seleccionada preferentemente del grupo que comprende polímeros policatiónicos, especialmente polipéptidos policatiónicos, desoxinucleótidos inmunoestimuladores (ODN); péptidos que contienen al menos dos motivos LysLeuLys; compuestos neuroactivos, especialmente una hormona de crecimiento humana; alumbre, adyuvantes completos o incompletos de Freund o combinaciones de estos.

32. Un kit de diagnóstico que comprende: