PROMOTOR DE METALOTIONEINA 2 DE MAIZ Y METODOS DE USO.

Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1;

b) una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia promotora vegetal del plásmido depositado como Depósito de Patente Núm. NRRL B-30793;

c) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 900 nucleótidos contiguos de la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1, donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula de la raíz de la planta; y,

d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene una identidad de al menos 95% con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1, donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula de la raíz de la planta

Promotor de metalotioneína 2 de maíz y métodos de uso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular de las plantas, más concretamente a la regulación de la expresión génica en plantas.

Antecedentes de la invención

La expresión de las secuencias de ADN heterólogas en un anfitrión vegetal depende de la presencia de un promotor conectado operablemente que es funcional dentro del anfitrión vegetal. La elección de la secuencia promotora determinará cuándo y dónde se expresa la secuencia de ADN heteróloga dentro del organismo. Cuando se desea la expresión en tejidos u órganos específicos, se pueden utilizar los promotores preferidos por el tejido. Cuando se desea la expresión génica en respuesta a un estímulo, los promotores inducibles son el elemento regulador de elección. En contraste, cuando se desea la expresión continua en todas las células de una planta, se utilizan promotores constitutivos. Se pueden incluir secuencias reguladoras adicionales aguas arriba y/o aguas abajo de la secuencia promotora núcleo en los constructos de expresión de los vectores de transformación para ocasionar niveles de expresión variables de secuencias de nucleótidos heterólogas en una planta transgénica.

Frecuentemente es deseable expresar una secuencia de ADN en tejidos u órganos concretos de una planta. Por ejemplo, se podría lograr un aumento de la resistencia de una planta a la infección por patógenos contenidos por el suelo y el aire por medio de la manipulación genética del genoma de la planta para que comprenda un promotor preferido por el tejido conectado operablemente a un gen de resistencia al patógeno heterólogo de manera que se produzcan proteínas de resistencia al patógeno en el tejido vegetal deseado.

Alternativamente, podría ser deseable inhibir la expresión de una secuencia de ADN nativa en un tejido de una planta para lograr un fenotipo deseado. En este caso, semejante inhibición se podría lograr con la transformación de la planta para que comprenda un promotor preferido del tejido conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos antisentido, de manera que la expresión de la secuencia antisentido produzca un transcrito de ARN que interfiera en la traducción del ARNm de la secuencia de ADN nativa.

Hasta ahora, la regulación de la expresión génica en las raíces de las plantas no se ha estudiado adecuadamente a pesar de la importancia de la raíz para el desarrollo de la planta. Hasta cierto punto esto es atribuible a la escasez de funciones bioquímicas específicas de la raíz, fácilmente asequibles cuyos genes puedan ser clonados, estudiados, y manipulados. Alterar genéticamente las plantas por medio del uso de técnicas de ingeniería genética y producir de este modo una planta con rasgos útiles requiere la disponibilidad de una variedad de promotores. Una acumulación de promotores permitiría al investigador diseñar moléculas de ADN recombinante que sean susceptibles de ser expresadas a niveles y en localizaciones celulares deseados. Por lo tanto, una colección de promotores preferidos por el tejido permitiría expresar un nuevo rasgo en el tejido deseado. Diversos genes han sido descritos por Takahashi et al. (1991) Plant J. 1:327-332; Takahashi et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8013-8016; Hertig et al. (1991) Plant Mol Biol. 16:171-174; Xu et al. (1995) Plant Mol Biol. 27:237-248; Capone et al. (1994) Plant Mol Biol. 25:681-691; Masuda et al. (1999) Plant Cell Physiol. 40(11):1177-81; Luschnig et al. (1998) Genes Dev. 12(14):2175-87; Goddemeier et al. (1998) Plant Mol Biol. 36(5):799-802; and Yamamoto et al. (1991) Plant Cell. 3(4):371-82 que se expresan preferentemente en tejidos de raíces de plantas.

Las metalotioneínas (MT) son proteínas o polipéptidos que se unen y secuestran formas iónicas de ciertos metales en tejidos de plantas y animales. Los ejemplos de tales metales incluyen cobre, zinc, cadmio, mercurio, oro, plata, cobalto, níquel y bismuto. Los metales específicos secuestrados por las MT varían para las proteínas/polipéptidos estructuralmente distintos que existen en los diferentes organismos. Las plantas parecen contener una diversidad de MT de unión a metales con el potencial de representar papeles distintos en el metabolismo de diferentes iones metálicos. En las plantas, se sugiere que las MT tienen papeles en la acumulación de metales, la intoxicación por metales, y la embriogénesis (Thomas et al. (2003) Biotechnol. Prog. 19:273-280; Dong y Dunstan (1996) Planta 199:459-466; Kawashima et al. (1992) Eur. J. Biochem. 209:971-976).

Típicamente, las MT y las proteínas de tipo MT son proteínas ricas en Cys que se caracterizan por la presencia de motivos Cys-Xaa-Cys que sugieren una capacidad de unión a iones metálicos. Se han propuesto categorías adicionales de proteína de tipo MT basándose en las localizaciones pronosticadas de los restos Cys y se han denominado tipo 1 y 2. En el tipo 1 existen exclusivamente motivos Cys-Xaa-Cys, mientras en el tipo 2 existe Cys-Cys y un par Cys-Xaa-Xaa-Cys en el dominio N terminal. El motivo de tipo 1 ha sido implicado en la unión y secuestro de cobre. (Murphy et al. (1997) Plant Physiol. 113:1293-1301 and Carr et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:31237-31242).

Se han aislado diferentes genes de tipo metalotioneína, incluyendo los de guisante, maíz, cebada, Mimulus (mímulo), soja, higuera del diablo y Arabidopsis. Véase Robinson et al. (1993) Biochem J. 295: 1-10. Se ha informado de que se han aislado secuencias expresadas en raíces de guisante, como describen Evans et al. (1990) FEBS Lett 262:29-32. Se ha descrito un gen de MT de raíz de maíz en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.466.785; aunque esta secuencia también es expresada en hojas, corteza blanca y semillas, como describe de Framond (1991) FEBS Lett 290:103-106.

De este modo, el aislamiento y la caracterización de promotores preferidos por los tejidos, concretamente preferidos por la raíz, que pueden servir como regiones reguladoras para la expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas de interés de una manera preferida por el tejido, son necesarios para la manipulación genética de las plantas.

Compendio de la invención

Se proporcionan las composiciones y métodos para regular la expresión de una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés en una planta o célula vegetal. Las composiciones comprenden secuencias de nucleótidos novedosas para promotores que inician la transcripción. Las realizaciones de la invención comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada en el SEQ ID NO: 1 o uno de sus complementos, la secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia del promotor vegetal del plásmido depositado como Núm. de Depósito de Patente NRRL B-30793 o uno de sus complementos, una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 900 nucleótidos contiguos del SEQ ID NO: 1, donde dicha secuencia inicia la transcripción en una célula vegetal, y una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con la secuencia mostrada en el SEQ ID NO: 1, donde dicha secuencia inicia la transcripción en la célula de la raíz de la planta.

Se proporciona un método para expresar una secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta o célula vegetal. El método comprende introducir en una planta o una célula vegetal una casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés conectada operablemente a uno de los promotores de la presente invención. De esta manera, las secuencias promotoras son útiles para controlar la expresión de la secuencia de nucleótidos heteróloga conectada operablemente. En métodos específicos, la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés se expresa de una manera preferida por la raíz.

Adicionalmente se proporciona un método para expresar una secuencia de nucleótidos de interés de una manera preferida por la raíz en una planta. El método comprende introducir en una célula vegetal una casete de expresión que comprende un promotor de la invención conectado operablemente a una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés.

La expresión de la secuencia de nucleótidos de interés puede proporcionar la modificación del fenotipo de la planta. Semejante modificación incluye modular la producción de un producto endógeno, en cuanto a la cantidad, la distribución relativa, o similar, o la producción de un producto de expresión exógeno para...

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: