PRODUCCION DE IL-21 EN HUESPEDES PROCARIOTAS.

Vector de expresión para producir la proteína IL-21 que comprende los siguientes elementos unidos operativamente:

(a) un origen de replicación procariota;

(b) un elemento de ADN de inicio de la transcripción;

(c) una secuencia de polinucleótidos tal como se muestra en la SEC ID NO: 27; y

(d) un terminador de la transcripción

Producción de IL-21 en huéspedes procariotas.

La mayor disponibilidad e identificación de genes de genomas humanos u otros genomas ha conducido a una mayor necesidad por una expresión eficaz y la purificación de proteínas recombinantes. La expresión de proteínas en bacterias es de lejos la estrategia más ampliamente utilizada para la producción de genes clonados. Por muchas razones, se prefiere la expresión en bacterias para la expresión en células eucariotas. Por ejemplo, las bacterias son mucho más fáciles de desarrollar que las células eucariotas. Más específicamente, la disponibilidad de una gran abundancia de herramientas genéticas moleculares sofisticadas y miles de mutantes hacen que E. coli, como huésped de expresión, sea extremadamente útil para la producción de proteínas. Sin embargo, la producción a nivel elevado de proteínas funcionales en E. coli, especialmente aquellas de origen eucariota, ha sido menudo difícil.

IL-21 (previamente denominado ligando Zalfa 11) es un miembro de la familia de citoquinas de IL-2 que también incluye IL-4, IL-7, IL-9, IL-13 e IL-15. Se ha observado que las proteínas en esta familia presentan efectos anticancerígenos y antivirales. IL-21 es producida por células T auxiliares, que son reguladores clave de inmunidad. En base a los patrones de expresión de su receptor afín y la administración de la proteína, se ha observado que IL-21 activa las células T asesinas CD8+ y células T asesinas (NK) naturales, dos clases de linfocitos que erradican tumores y células viralmente infectadas. La IL-21 también estimula clases seleccionadas de células B (Parrish et al., 408: 57-63, 2000).

La IL-21 recombinante se ha producido en células procariotas, en particular E. coli. La proteína bacteriana producida resultante no está glicosilada, y se produce en un estado agregado. La producción de IL-21 de E. coli requiere que las proteínas agregadas se solubilicen a partir de los cuerpos de inclusión insolubles y se renaturalicen o replieguen. Sin la renaturalización, la actividad específica de la proteína recombinante se reducirá significativamente.

A pesar de los avances en la expresión de proteínas recombinantes en huéspedes bacterianos, existe la necesidad de métodos mejorados para la producción de proteínas IL-21 recombinantes purificadas y biológicamente activas en sistemas procariotas que dan lugar a rendimientos superiores para la protección de proteínas. Estos y otros aspectos de la invención serán evidentes tras hacer referencia a la siguientes descripción detallada.

El documento US 6,307,024 describe moléculas de polinucleótidos y polipéptidos del ligando zalfa 11, y métodos y usos relacionados.

Kane J. F., Current Opinion in Biotechnology, Vol. 6, No. 5, October 1995, páginas 494-500, describen los efectos de agrupaciones de codones raros sobre la expresión de nivel elevado de proteínas heterólogas en E. coli.

Weir M. P. et al., Biochemical Journal, Vol. 245, No. 1, 1 July 1987, páginas 85-91, describen la purificación y renaturalización de IL-2 recombinante humana.

Asano R. et al., FEBS Letters, Vol. 528, No 1-3, 25 September 2002, páginas 70-76, describen la actividad antitumoral de IL-21 preparada mediante un procedimiento de repliegue a partir de cuerpos de inclusión expresados en E. coli.

La presente invención proporciona un vector de expresión para producir la proteína IL-21 que comprende los siguientes elementos unidos operativamente.

        (a)        un origen de replicación procariota;

        (b)        un elemento de ADN de inicio de la transcripción;

        (c)        una secuencia de polinucleótidos tal como se muestra en la SEC ID NO: 27; y

        (d)        un terminador de la transcripción.

La presente invención también proporciona un método para producir proteínas IL-21, tal como se define las reivindicaciones.

En un aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión para producir proteínas IL-21 que comprende los elementos unidos operativamente de un origen de replicación procariota, un elemento de ADN de inicio de la transcripción, y una secuencia de polinucleótidos tal como se muestra en la SEC ID no. 27 y un terminador de la transcripción. En otro aspecto, el vector de expresión es el vector pTAP337. En realizaciones adicionales que proporcionan el vector de expresión pueden incluir un marcador seleccionable.

En otro aspecto, la presente invención proporciona células huésped procariotas transformadas con los vectores de expresión descritos como que comprenden la SEC ID no. 27 o el vector pTAP337. En otras realizaciones, la cepa huésped es la cepa de E. coli W3110 o la cepa zGOLD1, depositadas con la American Type Culture Collection en Manassas, VA.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos (tal como se define en las reivindicaciones) para producir las proteínas IL-21 en condiciones en las que se expresa la proteína IL-21. En una realización, el método comprende cultivar una célula huésped que expresa IL-21 después de transformarse con pTAP337. El método comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende la SEC ID No. 27. El método también comprende recuperar células huésped del medio de crecimiento y, a continuación, aislar la proteína IL-21 de las células huésped.

En otros aspectos, la presente invención proporciona métodos (tal como se define en las reivindicaciones) para producir IL-21 que comprende las etapas descritas anteriormente, en un proceso de fermentación por alimentación discontinua o un proceso de fermentación por lotes.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos (tal como se define en las reivindicaciones) para producir proteína IL-21 que comprende cultivar una célula huésped tal como se describe anteriormente en un matraz de agitación hasta una DO600 de 5 a 20 en un medio de crecimiento, inocular un recipiente de fermentación con un 1 a 12% v/v de medio del matraz de agitación que contiene células huésped, cultivar las células huésped en un medio de crecimiento a un pH de 6,2 a 7,2, donde se introduce una solución de alimentación en el recipiente de fermentación antes del tiempo de fermentación transcurrido (EFT) de 15 horas, la adición de un agente de inducción al recipiente de fermentación al EFT de 20 a 30 horas, y recoger las células huésped al EFT de 48 a 56 horas. En una realización, el agente de inducción es tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) a 0,5 a 2 mM. En otra realización, la solución de alimentación comprende un carbohidrato seleccionado del grupo que consiste en glicerol y glucosa y la alimentación es de 5 a 15 gramos de carbohidrato por hora. En otra realización, el glicerol en la solución de alimentación es del 40 al 70% v/v de glicerol o la glucosa es del 40 al 70% p/v de glucosa. En realizaciones adicionales, el glicerol es aproximadamente del 70% v/v o la glucosa es aproximadamente del 60% p/v.

En un aspecto, la presente invención proporciona métodos de producción de L- 21 que comprende el sembrado en una matraz con un inóculo que comprende una célula huésped W3110 de E. coli que comprende un vector de expresión tal como se define en las reivindicaciones (por ejemplo, la célula huésped W3110 de E. coli que comprende el vector pTAP337), en el que se expresa un polipéptido IL-21 y con un medio de crecimiento que comprende aproximadamente glicerol 5 g/l, el cultivo del inóculo en un medio de crecimiento durante 16 a 20 horas a aproximadamente 30ºC, la transferencia del inóculo cultivado en el medio de crecimiento a un fermentador por lotes a una concentración de 0,5 a 5% v/v de inóculo, la fermentación de la fermentación por lotes a aproximadamente a 37ºC y aproximadamente pH 6,8 con aproximadamente glicerol al 2%, la introducción de una alimentación de glucosa a un EFT de aproximadamente 8 horas de aproximadamente 9,5 g glucosa/litro/hora y la continuación hasta el final del desarrollo de la fermentación, la adición de IPTG a un...

1. Vector de expresión para producir la proteína IL-21 que comprende los siguientes elementos unidos operativamente:

(a) un origen de replicación procariota;

(b) un elemento de ADN de inicio de la transcripción;

(c) una secuencia de polinucleótidos tal como se muestra en la SEC ID NO: 27; y

(d) un terminador de la transcripción.

2. Vector de expresión según la reivindicación 1, que comprende además un marcador seleccionable.

3. Vector de expresión según la reivindicación 2, en el que dicho marcador seleccionable comprende un gen de resistencia a kanamicina.

4. Célula huésped procariota transformada con un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Célula huésped según la reivindicación 4, en la que la célula huésped es la cepa W3110 de E. coli.

6. Célula huésped según la reivindicación 5, depositada en la American Type Culture Collection en Manassas, VA. bajo la Designación de Depósito para Patente PTA-4853.

7. Célula huésped según la reivindicación 4, en la que la célula huésped es una cepa deficiente de proteasa OmpT.

8. Célula huésped según la reivindicación 7, en la que la célula huésped es una cepa deficiente de proteasa OmpT de E. coli W3110.

9. Método para producir proteínas IL-21, que comprende:

(a) cultivar una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 en un medio de crecimiento bajo condiciones en las que se expresa IL-21;

(b) recuperar las células huésped del medio de crecimiento; y

(c) aislar la proteína IL-21 de las células huésped.

10. Método según la reivindicación 9, en el que la célula huésped se cultiva mediante fermentación por alimentación discontinua.

11. Método según la reivindicación 9, en el que dicha etapa de cultivo comprende:

(a) cultivar dicha célula huésped en un matraz de agitación hasta una DO600 de 5 a 20 en un medio de crecimiento;

(b) inocular un recipiente de fermentación con 1 a 12% v/v de medio del matraz de agitación que contiene células huésped;

(c) cultivar las células huésped en un medio de crecimiento a un pH de 6,2 a 7,2, en el que se introduce una solución de alimentación en el recipiente de fermentación antes de un tiempo de fermentación transcurrido (EFT) de 15 horas; y

(d) añadir un agente inductor al recipiente de fermentación a un EFT de 20 a 30 horas;

y en el que dicha etapa de recuperación comprende recoger las células huésped a un EFT de 48 a 56 horas.

12. Método según la reivindicación 11, en el que el agente inductor es tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) a una concentración de 0,5 a 2 mM.

13. Método según la reivindicación 11, en el que la solución de alimentación comprende un carbohidrato seleccionado del grupo que consiste en glicerol y glucosa a una concentración de medio de crecimiento, y una velocidad de alimentación de 5-15 gramos de carbohidrato por hora.

14. Método según la reivindicación 13, en el que el glicerol es del 40 al 70% v/v en glicerol o la glucosa es del 40 al 70% p/v en glucosa.

15. Método según la reivindicación 13, en el que el glicerol es del 70% v/v o la glucosa es del 60% p/v.

16. Método según la reivindicación 9, en el que dicha etapa de cultivo comprende:

(a) sembrar un matraz con un inóculo que comprende una célula huésped de E. coli W3110 que comprende un vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que se expresa un polipéptido IL-21, y con un medio de crecimiento que comprende glicerol 5 g/L;

(b) cultivar el inóculo en el medio de crecimiento durante 16-20 horas a 30ºC;

(c) transferir el inóculo cultivado en un medio de crecimiento a un fermentador por lotes a una concentración de inóculo de 0,5-5% v/v;

(d) fermentar la fermentación por lotes a 37ºC y pH 6,8; con glicerol al 2%;

(e) introducir una alimentación de glucosa a un tiempo de fermentación transcurrido (EFT) de 8 horas de 9,5 g glucosa/litro/hora y que continúa hasta el final de la reacción de fermentación;

(f) añadir IPTG a un EFT de 24 horas hasta una concentración final de 0,5 a 2 mM;

(g) fermentar 28 horas después de la adición de IPTG;

y en el que dicha etapa de recuperación comprende recoger el caldo de fermentación del fermentador;

y en el que dicha etapa de aislamiento comprende añadir un volumen igual de agua al caldo de fermentación y homogeneizar y centrifugar el caldo de fermentación para recoger un residuo celular o emulsión celular que comprende material proteico de IL-21.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9-16, en el que dicha proteína IL-21 comprende una secuencia de residuos de aminoácidos tal como se muestra en la SEC ID No. 28, y en el que dicha etapa de aislamiento comprende además:

(a) separar el material proteico de IL-21 insoluble en agua de un residuo celular o emulsión celular;

(b) disolver el material proteico de IL-21 insoluble en un disolvente caotrópico;

(c) diluir el disolvente caotrópico y replegar la proteína IL-21; en el que la proteína IL-21 aislada es capaz de ser biológicamente activa.

18. Método según la reivindicación 17, en el que dicha etapa de aislamiento comprende además eliminar las proteínas no plegadas y agregadas de dicha proteína IL-21 replegada mediante filtración, y en el que dicho método comprende además

(d) purificar la proteína IL-21 replegada en una columna de intercambio catiónico.

19. Método según la reivindicación 18, en el que la proteína IL-21 aislada tiene por lo menos un 90% de pureza.

20. Método según la reivindicación 19 en el que la proteína IL-21 aislada tiene un nivel de endotoxina inferior a 10 unidades de endotoxina por mg de proteína IL-21.

21. Método según la reivindicación 18, que comprende la etapa inicial de separar de un caldo de fermentación un residuo celular o emulsión celular que comprende material proteico de IL-21 insoluble en agua;

en el que dicha etapa de separación (a) según la reivindicación 17, comprende homogeneizar el residuo celular o la emulsión celular para recoger los cuerpos de inclusión;

en el que dicho disolvente caotrópico comprende una sal de guanidina, y

en el que el disolvente caotrópico se diluye mediante la adición de un tampón de repliegue que comprende sales de arginina y una mezcla de componentes reductores y oxidantes.

22. Método según la reivindicación 21, que comprende además la etapa de:

(e) purificar el eluato de Il-21 de la columna de intercambio catiónico en una columna de interacción hidrofóbica, en el que la proteína IL-21 aislada y purificada es capaz de ser biológicamente activa.

23. Método según la reivindicación 18, en el que dicha etapa de separación (a) según la reivindicación 17 comprende homogeneizar el residuo celular o la emulsión celular para recoger cuerpos de inclusión; dicha etapa de disolución (b) según la reivindicación 17 comprende disolver la proteína IL-21 insoluble en un disolvente caotrópico que comprende clorhidrato de guanidina 6 M, ditiotreitol 40 mM (DTT) durante una hora a temperatura ambiente; dichas etapas de dilución y repliegue (c) según la reivindicación 17 comprende:

(a) replegar los cuerpos de inclusión disueltos en una solución mediante la dilución en tampón de repliegue que comprende arginina 0,75 mM, pareja de oxidación-reducción DTT 2 mM/cistina 4 mM por lo menos 20 veces;

(b) ajustar el pH a 5,5 con ácido acético al 20% y dejar que la solución reaccione durante por lo menos 5 horas;

(c) diluir la solución con 1 + 1,4 volúmenes de acetato 25 mM, pH 5,5:

y en el que dichas etapas de filtración y purificación según la reivindicación 18, comprende: