Procedimiento de producción de ácidos dicarboxílicos, caracterizado por que comprende:

a) una fase de crecimiento, en la que se cultiva una cepa mutante de Yarrowia lipolytica que tiene alterados al menos los genes que codifican las isoenzimas de acil-CoA oxidasa POX2, POX3, POX4 y POX5; en un medio de cultivo constituido esencialmente por un sustrato energético que comprende al menos una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno;

b) una fase de bioconversión, en la que se somete a dicha cepa a un sustrato de bioconversión seleccionado entre n-alcanos de al menos 10 átomos de carbono, ácidos grasos de al menos 10 átomos de carbono, ésteres de alquilo de 1 a 4 átomos de carbono de estos ácidos grasos, y aceites naturales, en presencia de un sustrato energético; y

c) una fase de recuperación del ácido dicarboxílico formado

Producción de ácidos dicarboxílicos mediante cepas mutantes mejoradas de Yarrowia lipolytica.

Campo de la invención

La invención se refiere a un procedimiento de producción de ácidos dicarboxílicos mediante una fermentación que emplea una cepa mutante de la levadura Yarrowia lipolytica a partir de un sustrato de bioconversión.

Los ácidos dicarboxílicos (también llamados "diácidos") se utilizan como materias primas, por ejemplo, en la síntesis de poliamidas y de poliésteres, de aceites lubricantes, de agentes plastificantes o de perfumes.

Los procedimientos de producción de los diácidos varían según el número de átomos de carbono del esqueleto carbonado del diácido en cuestión (Johnson RW, Pollock CM, Cantrell RR, Editors Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4^th Edition, 1983, págs. 118-136). De este modo, el ácido azelaico (diácido de C9) se obtiene convencionalmente mediante oxidación química del ácido oleico con ozono mientras que el ácido sebácido (diácido de C10) se produce mediante oxidación alcalina del ácido ricinoleico. El ácido dodecanodioico (diácido de C12) es un producto petroquímico. La vía microbiológica se utiliza para la producción de ácido brasílico (diácido de C13) a partir de tridecano.

Teniendo en cuenta la diversidad de los diácidos que se utilizan en las diferentes aplicaciones, el interés de una vía de producción aplicable a la más amplia gama posible de diácidos es incontestable. Aunque caracterizándose por una velocidad de reacción más lenta que la de la vía química, la vía biológica presenta el interés de ser aplicable a gran variedad de sustratos (el proceso de producción de diácidos por vía biológica se representa esquemáticamente en la figura 1).

De hecho, numerosas especies microbianas silvestres tales como Cryptococcus neoformans, Pseudomonas aeruginosa, Candida cloacae, etc. son capaces de excretar pequeñas cantidades de diácidos (Chan et al., Stimulation of n-alkane conversion to dicarboxylic acid by organic-solvent- and detergent-treated microbes. Appl. Microbiol. Biotechnol., 34, 1991, 772-777; Shiio et al.: Microbial Production of Long-chain Dicarboxylic Acids from n-Alkanes. Part I. Screening and Properties of Microorganisms Producing Dicarboxylic Acids. Agr. Biol. Chem. 35, No. 13, 1971, págs. 2033-2042).

Sin embargo, para obtener excreciones sustanciales de diácidos, es conveniente utilizar mutantes que hayan sido bloqueados a nivel de la ß-oxidación. Para muchas especies, dichos mutantes se obtuvieron mediante una mutagénesis aleatoria, seguida de una selección apropiada (patente EP 0 229 252 B1; Shiio et al.; Jiao et al. Isolation and Enzyme Determination of Candida tropicalis Mutants for DCA Production. J. Gen. Appl. Microbiol. 2000, 46: 245-249). Una vía mucho más elegante, pero más exigente, que emplea las técnicas de mutagénesis dirigida, se ha desarrollado sin embargo para Candida tropicalis. A partir de una cepa silvestre que pertenece a esta especie, Picataggio et al., alteraron secuencialmente los cuatro genes que codifican las dos isoenzimas de acil-CoA oxidasa (Aox) que catalizan la primera etapa de la ß-oxidación (Determination of Candida tropicalis Acylcoenzyme A Oxidase Isoenzyme Function by Sequential Gene Disruption. Mol. Cell. Biol. 11, 1991, 4333-4339, y Patente de Estados Unidos Nº 5254466 A1).

Estos mismos autores sobreexpresaron a continuación los genes que codifican la citocromo P450 monooxigenasa y la NADPH-citocromo reductasa, que constituyen las actividades que limitan la cinética de la conversión de los n-alcanos en diácidos (Picataggio et al.: Metabolic Engineering of Candida tropicalis for the Production of Long-chain Dicarboxylic Acids. Biotechnol. 10, 1992, 894-898, y Patente de Estados Unidos Nº 5 648 247 A1). Sin embargo, los mutantes de Candida tropicalis producidos de acuerdo con un sistema de amplificación de múltiples copias no parecen totalmente estables y se prestan a posibles reversiones. Es por esta razón que se han debido aportar mejoras a la técnica anterior (Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 2004/0014198 A1).

Whang et al., (J. of Bacteriology, vol. 181, nº 17, septiembre de 1999, páginas 5140-5148) describe mutantes de Yarrowia lipolytica cuyos genes que codifican acil-CoA oxidasa han sido alterados.

Wache et al., (Applied and Environmental Microbiology, vol 67, nº 12, diciembre de 2001, páginas 5700-5704) describe la transformación de ricinoleato en ?-decalactona, mediante cepas mutantes de Yarrowia lipolytica en las que se han alterado los genes que codifican acil-CoA oxidasa.

Objeto de la invención

El objeto de la invención es remediar los inconvenientes de la técnica anterior. Se ha descubierto, en efecto, que era posible, de manera ventajosa, producir diácidos utilizando mutantes de Yarrowia lipolytica cuyos genes que codifican acil-CoA oxidasa han sido alterados.

Los diácidos que el procedimiento de la invención pretende preparar son compuestos orgánicos de cadena hidrocarbonada lineal de al menos 10 átomos de carbono que comprenden una función carboxílica en cada extremo de la cadena.

Se utiliza como microorganismo un mutante de Yarrowia lipolytica en el que al menos los genes POX2, POX3, POX4 y POX5 han sido alterados, para bloquearlo parcialmente a nivel de la ß-oxidación.

Aparte de las acil-CoA oxidasas codificadas por los genes POX2, POX3, POX4 y POX5, otras dos acil-CoA oxidasas codificadas por los genes POX1 y POX6, de función desconocida, están presentes en el genoma de Yarrowia lipolytica.

Estas dos acil-CoA oxidasas están implicadas en el consumo de nuevo de los diácidos biosintetizados mediante eliminación secuencial de dos átomos de carbono. La alteración suplementaria de los genes POX1 y POX6 conlleva por lo tanto la producción de diácidos que corresponden al perfil del sustrato de bioconversión. Por ejemplo, si se utiliza el aceite de girasol oleico, compuesto en su mayoría por ácidos grasos con 18 átomos de carbono, como sustrato de bioconversión, la cepa a la que se le delecionó el conjunto de los genes POX, producirá en su mayoría diácidos con 18 átomos de carbono.

Por otro lado, el sustrato de bioconversión puede almacenarse en forma de triglicéridos en la propia célula en forma de cuerpos lipídicos y volverse, por lo tanto, inaccesible para su bioconversión en diácidos. Se identificaron genes, mediante análisis proteómico, que estaban implicados en la acumulación del sustrato de bioconversión. Se identificaron los genes: DGA1 (acil-CoA:diacilglicerol aciltransferasa) TGL1 (triacilglicerol lipasa), G3P (glicerol-3-fosfato deshidrogenasa), SCP2 (supuesto transportador de esterol), LR01 (supuesta lecitina colesterol aciltransferasa) así como los IFP 621 (función desconocida), IPF 905 (función desconocida), e IPF 2569 (sub-unidad NADH-ubiquinona reductasa).

La modificación de la actividad de estos genes (mediante alteración o sobreexpresión) conlleva, por lo tanto, una disminución de la acumulación del sustrato de bioconversión en forma de cuerpos lipídicos en el interior de la célula de Yarrowia lipolytica.

Se observará que el sistema genético de Yarrowia lipolytica es muy diferente del de Candida tropicalis. Al contrario que Candida tropicalis que es una levadura diploide, Yarrowia lipolytica es, en efecto, una especie haploide. En este último microorganismo, las operaciones de deleción génica son, por lo tanto, mucho más eficaces y más seguras, debido también a la presencia de un único juego de cromosomas.

Por otro lado, un promotor del gen POX2 que codifica acil-CoA oxidasa se utiliza para sobreexpresar genes tales como, por ejemplo, los que codifican la citocromo P450 mono-oxigenasa y la NADPH-citocromo reductasa. El promotor pPOX2 tiene la propiedad de ser un promotor fuerte inducible por los sustratos de bioconversión. De este modo, la sobreexpresión de un gen de interés se realiza mediante la adición de una sola copia del gen bajo el control del promotor pPOX2, permitiendo obtener mutantes de Yarrowia lipolytica eficaces, estables y que no revierten, al contrario que los mutantes de Candida tropicalis obtenidos mediante un sistema de amplificación de múltiples copias.

 

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Reivindicaciones:

1. Procedimiento de producción de ácidos dicarboxílicos, caracterizado por que comprende:

a) una fase de crecimiento, en la que se cultiva una cepa mutante de Yarrowia lipolytica que tiene alterados al menos los genes que codifican las isoenzimas de acil-CoA oxidasa POX2, POX3, POX4 y POX5; en un medio de cultivo constituido esencialmente por un sustrato energético que comprende al menos una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno;

b) una fase de bioconversión, en la que se somete a dicha cepa a un sustrato de bioconversión seleccionado entre n-alcanos de al menos 10 átomos de carbono, ácidos grasos de al menos 10 átomos de carbono, ésteres de alquilo de 1 a 4 átomos de carbono de estos ácidos grasos, y aceites naturales, en presencia de un sustrato energético; y

c) una fase de recuperación del ácido dicarboxílico formado.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el mutante utilizado es MTLY37, obtenido de la cepa silvestre ATCC 20460, catalogada como CLIB89 en la Collection de Levures d'intérêt Biotechnologique, y obtenido mediante las siguientes operaciones de transformación a partir de la cepa Po1d catalogada como CLIB139 en la Collection de Levures d'intérêt Biotechnologique,

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el mutante utilizado es MTLY79, obtenido de la cepa silvestre ATCC 20460, catalogada como CLIB89 en la Collection de Levures d'intérêt Biotechnologique, que sobreexpresa los genes CPR y ALK1 que codifican respectivamente la NADPH-citocromo reductasa y la citocromo P450 monooxigenasa, y obtenido mediante las siguientes operaciones de transformación a partir del mutante MTLY74, obtenido a su vez a partir del mutante MTLY37 tal como se describe en la reivindicación 2 de acuerdo con las siguientes operaciones de transformación:

4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el mutante utilizado es MTLY80, obtenido de la cepa silvestre ATCC 20460, catalogada como CLIB89 en la Collection de Levures d'intérêt Biotechnologique, que sobreexpresa los genes CPR y ALK2 que codifican respectivamente la NADPH-citocromo reductasa y la citocromo P450 monooxigenasa, y obtenido mediante las siguientes operaciones de transformación a partir del mutante MTLY74, tal como se describe en la reivindicación 3

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el mutante utilizado es MTLY81, obtenido de la cepa silvestre ATCC 20460, catalogada como CLIB89 en la Collection de Levures d'intérêt Biotechnologique, que sobreexpresa el gen CPR que codifica la NADPH-citocromo reductasa, y obtenido mediante las siguientes operaciones de transformación a partir del mutante MTLY74, tal como se describe en la reivindicación 3

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el mutante utilizado es FT120, obtenido de la cepa silvestre ATCC 20460, catalogada como CLIB89 en la Collection de Levures d'intérêt Biotechnologique, que sobreexpresa el gen CPR que codifica la NADPH-citocromo reductasa, y obtenido mediante las siguientes operaciones de transformación a partir del mutante MTLY66, tal como se describe en la reivindicación 3

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que el mutante utilizado es FT130, obtenido de la cepa silvestre ATCC 20460, catalogada como CLIB89 en la Collection de Levures d'intérêt Biotechnologique, que sobreexpresa el gen CPR que codifica la NADPH-citocromo reductasa, y obtenido mediante las siguientes operaciones de transformación a partir del mutante FT120, tal como se describe en la reivindicación 6

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que dicho sustrato de bioconversión está constituido por una mezcla de ésteres metílicos o una mezcla de ésteres etílicos.

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que dicho sustrato de bioconversión está constituido por un aceite de girasol oleico.

10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que, en la fase de bioconversión, el medio de cultivo comprende peptona.

11. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que, en la fase de bioconversión, el medio de cultivo comprende un aporte de sustrato energético secundario que está constituido por al menos un compuesto polihidroxilado.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado por que dicho compuesto polihidroxilado es glicerol o un azúcar.

13. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que, en la fase (c), el ácido dicarboxílico se recupera mediante precipitación en forma de sal de calcio.

14. Cepa de Yarrowia lipolytica mutante MTLY66 depositada en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes con el número de registro CNCM 1-3319.

15. Cepa de Yarrowia lipolytica mutante MTLY81 depositada en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes con el número de registro CNCM 1-3320.

16. Cepa de Yarrowia lipolytica mutante FT120 depositada en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes con el número de registro CNCM 1-3527.

17. Cepa de Yarrowia lipolytica mutante FT130 depositada en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes con el número de registro CNCM 1-3528.

 

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