PROCESOS Y VECTORES PARA LA AMPLIFICACION O EXPRESION DE SECUENCIAS DE ACIDO NUCLEICO DE INTERES EN PLANTAS.
Un proceso para causar la amplificación y/o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés en una planta,
tejido vegetal, célula vegetal o cultivo celular, caracterizado por que la célula vegetal se proporciona con por lo menos dos vectores precursores diseñados para experimentar procesamiento por recombinación de sitio específico en dicha célula vegetal, donde debido al procesamiento por recombinación de sitio específico entre dichos vectores precursores, se dota a dicha célula vegetal con por lo menos un replicón capaz de replicación autónoma in dicha célula vegetal, donde dicho replicón proporciona a dicha amplificación y/o expresión
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W0203476EP.
Solicitante: ICON GENETICS AG
ICON GENETICS, INC.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: MAXIMILIANSTR. 38/40,80539 MUNCHEN.
Inventor/es: GLEBA,YURI, KLIMYUK,VICTOR, MARILLONNET,SYLVESTRE, GILS,MARIO, SKULACHEV,MAXIM.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/08 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Virus ARN.
- C12N15/82B
Clasificación PCT:
- A01H5/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS. › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
- C12N15/82 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para células vegetales.
Clasificación antigua:
Fragmento de la descripción:
Procesos y vectores para la amplificación o expresión de secuencias de ácido nucleico de interés en plantas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procesos y vectores para causar la amplificación o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés en una célula vegetal.
Antecedentes de la invención
El progreso significativo en la biotecnología vegetal durante las últimas dos décadas ha ampliado las oportunidades de agricultura molecular a escala comercial en plantas. La producción de proteínas recombinantes en plantas es una alternativa atractiva con respecto a los sistemas más tradicionales basados en bacterias y levaduras. Tiene una ventaja evidente con respecto a los sistemas existentes basados en producción de fermentadores debido a su menor costo y la facilidad de aumento de escala de la producción al simplemente incrementar la recolección de la biomasa vegetal.
En general, la agricultura molecular en plantas se puede conseguir mediante la expresión estable o transitoria de una proteína recombinante de interés (Franken et al., 1997, Curr. Opin. Biotechnol., 8, 411-416; Fischer et al., 1999, Biotechnol. Appl. Biochem., Pt 2, 101-108; Herbers & Sonnewald, 1999, Curr. Opin. Biotechnol., 10, 163-168). Se pueden usar plantas transgénicas estables para producir tejidos vegetativos o semillas ricas en proteína recombinante. Tejido vegetativo puede usarse directamente para el procesamiento mientras que las semillas son más adecuadas para almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, para alcanzar un elevado nivel de expresión de proteína en plantas no es una tarea común, especialmente para la producción de proteínas que comprometen el crecimiento de la planta. Requiere el desarrollo de sistemas de expresión regulados apropiadamente, por tanto permitiendo activar la producción de proteína en la etapa correcta del desarrollo de la planta.
Las tecnologías existentes para controlar la expresión de genes en plantas habitualmente se basan en promotores específicos de tejido e inducibles y prácticamente la totalidad de estos sufren de una actividad de expresión basal incluso cuando no son inducidos, es decir, son "permeables". Los promotores específicos de tejido (US05955361; WO09828431) presentan una herramienta poderosa pero su uso se limita a áreas de aplicaciones muy específicas, por ejemplo, para producir plantas estériles (WO9839462) o expresar genes de interés en semillas (WO00068388; US05608152). Los promotores inducibles se pueden dividir en dos categorías de acuerdo con sus condiciones de inducción - aquellos inducidos por factores abióticos (temperatura, luz, sustancias químicas) y aquellos que se pueden inducir por factores bióticos, por ejemplo, ataque de patógenos o plagas. Ejemplos de la primera categoría son los promotores inducibles por calor (US 05187287) e inducibles por frío (US05847102), un sistema inducible por cobre (Mett et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 4567-4571), sistemas inducibles por esteroides (Aoyama & Chua, 1997, Plant J, 11, 605-612; McNellis et al., 1998, Plant J., 14, 247-257; US06063985), un sistema inducible por etanol (Caddick et al., 1997, Nature Biotech., 16, 177-180; WO09321334), y un sistema inducible por tetraciclina (Weinmann et al., 1994, Plant J., 5, 559-569). Uno de los últimos avances en el área de los sistemas inducibles químicamente para plantas es un promotor quimérico que puede ser activado por el glucocorticoide dexametasona y que puede ser inactivado por tetraciclina (Bohner et al., 1999, Plant J., 19, 87-95). Para una revisión de sistemas inducibles químicamente véase: Zuo & Chua, (2000, Current Opin. Biotechnol., 11, 146-151). Otros ejemplos de promotores inducibles son los promotores que controlan la expresión de genes relacionados con patogénesis (PR) en plantas. Estos promotores pueden ser inducidos por tratamiento de la planta con ácido salicílico, un componente importante de las rutas de señalización de plantas en respuesta al ataque de patógenos u otros compuestos químicos (benzo-1,2,3-tiadiazol o ácido isonicotínico) que son capaces de activar la expresión del gene PR (US05942662).
Existen informes de sistemas de expresión transgénica controlable usando ARN/ARN polimerasa viral proporcionados por infección viral (véase por ejemplo US6093554; US5919705). En estos sistemas, una secuencia de ADN vegetal recombinante incluye las secuencias de nucleótidos del genoma viral reconocido por el ARN/ARN polimerasa viral. La eficacia de estos sistemas es limitada debido a la baja capacidad de polimerasas virales en proporcionar funciones in trans y su incapacidad para controlar procesos aparte de amplificación de ARN.
Los sistemas descritos anteriormente son de interés significativo como oportunidades para obtener patrones deseados de expresión transgénica, pero no permiten un control estricto sobre los patrones de expresión, en tanto que los agentes inductores (cobre) o sus análogos (brasinoesteroides en el caso de un sistema controlable por esteroides) pueden estar presentes en tejidos vegetales a niveles suficientes para provocar expresión residual. De manera adicional, el uso de antibióticos y esteroides como inductores químicos no es deseable para aplicaciones a gran escala. Cuando se usan promotores de genes PR o ARN/ARN polimerasas virales como medios de control para transgenes, los requerimientos de un control estricto sobre la expresión transgénica tampoco se satisface, en tanto que infección o estrés ocasional por un patógeno pueden causar la expresión. Los promotores específicos de tejido o de órgano se limitan a áreas muy estrechas de aplicaciones ya que confinan la expresión a un órgano o a una etapa específica del desarrollo de la planta, pero no permiten que el transgen se active a voluntad.
Una manera de conseguir un elevado nivel de producción de proteína es la expresión transitoria, en donde el transgen se puede distribuir y expresar en la etapa deseada del desarrollo de la planta, aprovechando por completo los recursos de la planta y permitiendo un rendimiento elevado del producto deseado. El planteamiento de expresión transitoria más adecuada para la producción de escala media a grande incluye sistemas mediados por Agrobacterium (Kapila et al., 1996, Plant Sci., 122, 101-108) y los mediados por vector viral vegetal (para revisión véase: Porta & Lomonossoff, 1996, Mol. Biotechnol., 5, 209-221; Yusibov et al., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 240, 81-94). Los sistemas de expresión basados en vector viral ofrecen un rendimiento significativamente mayor del producto transgénico en comparación con los transgenes nucleares de la planta. Por ejemplo, el nivel de la proteína transgénica puede alcanzar 5-10% del contenido total celular de la planta, cuando se expresa desde un vector viral (Kumagai et al., 2000, Gene, 245, 169-174; Shivprasad et al., 1999, Virology, 255, 312-323). Los virus ARN son los más adecuados ya que ofrecen un mayor nivel de expresión en comparación con los virus ADN. Existen varias patentes publicadas que describen vectores virales adecuados para expresión sistémica de material transgénico en plantas (US5316931; US5589367; US5866785). En general, estos vectores pueden expresar un gen extraño como una fusión traduccional con una proteína viral (US5491076; US5977438), desde un promotor subgenómico adicional (US5466788; US5670353; US5866785), o desde ARN viral policistrónico usando elementos IRES para traducción independiente de proteínas (Solicitud de Patente Alemana Número 10049587.7, solicitud PCT PCT/EP01/11629). El primer planteamiento - fusión traduccional de una proteína recombinante con una proteína estructural viral (Hamamoto et al., 1993, BioTechnology, 11, 930-932; Gopinath et al., 2000, Virology, 267, 159-173; JP6169789; US5977438) proporciona un rendimiento significativo. Sin embargo, el uso de tal planteamiento es limitado, ya que la proteína recombinante no se puede separar fácilmente de la viral. Una de las versiones de este planteamiento emplea la fusión traduccional a través de una secuencia de péptidos reconocida por una proteasa viral de sitio específico o a través de un péptido catalítico (Dolja et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10208- 10212; Gopinath et al., 2000, Virology, 267, 159-173; US5162601; US5766885; US5491076).
Reivindicaciones:
1. Un proceso para causar la amplificación y/o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés en una planta, tejido vegetal, célula vegetal o cultivo celular, caracterizado por que la célula vegetal se proporciona con por lo menos dos vectores precursores diseñados para experimentar procesamiento por recombinación de sitio específico en dicha célula vegetal, donde debido al procesamiento por recombinación de sitio específico entre dichos vectores precursores, se dota a dicha célula vegetal con por lo menos un replicón capaz de replicación autónoma in dicha célula vegetal, donde dicho replicón proporciona a dicha amplificación y/o expresión.
2. El proceso de la reivindicación 1, donde dicho proporcionamiento a la célula vegetal con un vector precursor se hace por transfección viral, distribución mediada por Agrobacterium, distribución no biológica, o por conversión de un vector preprecursor ADN que se pre-integrado en un ADN nuclear vegetal para formar un vector precursor o vectores precursores.
3. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde el vector precursor es de origen de virus vegetal.
4. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el vector precursor es de origen de virus de ADN.
5. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el vector precursor es de origen de virus de ARN.
6. El proceso como de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el vector precursor es esencialmente de origen de retrotransposón.
7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el procesamiento del vector precursor es por modificación de ADN.
8. El proceso de la reivindicación 7, donde dicho proceso comprende la producción de un conjunto de por lo menos dos replicones del tipo AB1, AB2,..., ABn o del tipo B1A, B2A, ..., BnA por recombinación de sitio específico de un vector (A) precursor primario con un conjunto de por lo menos dos vectores precursores secundarios (B1, B2, ..., Bn), donde n es un número entero = 2.
9. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde se proporcionan condiciones que facilitan el procesamiento del vector precursor para dar dichos replicones.
10. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la célula vegetal es silvestre.
11. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la célula vegetal se modifica por ingeniería genética de manera que proporciona las funciones necesarias para dicho procesamiento en la célula vegetal.
12. El proceso de la reivindicación 11, donde la célula vegetal se modifica por ingeniería genética de manera que proporciona in trans una o más funciones necesarias para la replicación del replicón, ensamblado de la partícula de virus, infectividad, supresión de silenciamiento por el hospedador, transcripción inversa, integración en un cromosoma hospedador, movimiento de célula a célula o a larga distancia de dichos replicones o para recombinación o corte y empalme.
13. El proceso de las reivindicaciones 11 ó 12, donde dicha modificación por ingeniería genética de dicha planta se hace por expresión transitoria, transfección mediada por virus o por Agrobacterium, integración estable en los genomas de núcleos u organelos o dentro de plásmidos de replicación autónoma de dicha célula vegetal.
14. El proceso de la reivindicación 1, donde la recombinación de por lo menos dos moléculas vectores precursores resulta en el ensamblado in vivo de un gen expresable dentro de un replicón, por lo que se combinan módulos de genes funcionales diferentes, tales como promotor, potenciador de transcripción, potenciador de traducción, terminador, partes codificantes de proteína de interés, péptidos de señal o de tránsito o de transporte de membrana, purificación o visualización de una etiqueta polipeptídica u otras proteínas de fusión, dichos diferentes módulos de genes funcionales originalmente se localizan en dos o más moléculas precursoras.
15. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que resulta en amplificación y/o expresión de dos o más secuencias de ácido nucleico de interés.
16. El proceso de la reivindicación 15, donde el proceso resulta en amplificación y/o expresión de genes múltiples de una ruta o cascada bioquímica.
17. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde uno o más de dichos replicones retienen capacidades virales adicionales tales como ensamblado de partícula viral, infectividad, supresión del silenciamiento genético, transcripción inversa, integración dentro del cromosoma hospedador, movimiento de célula a célula, o movimiento a larga distancia.
18. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde uno de dichos replicones es esencialmente un virus de tipo silvestre que proporciona en condiciones in trans necesarias para replicación de otro replicón o replico- nes.
19. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde uno de los replicones es esencialmente un virus de tipo auxiliar que proporciona in trans funciones necesarias para replicación de otro replicón o replicones.
20. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde uno de dichos replicones es esencialmente un retrovirus de tipo silvestre o retrotransposón el cual proporciona, in trans, funciones necesarias para replicación, transcripción inversa, integración en el cromosoma hospedador de otro replicón o replicones.
21. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 20, donde por lo menos dos de dichos replicones cooperan funcionalmente entre si.
22. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 21, donde por lo menos uno de dichos replicones proporciona además para una expresión de productos necesarios para replicación de los replicones.
23. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, donde por lo menos uno de dichos replicones proporciona además para expresión de productos necesarios para movimiento de una célula a otra, larga distancia o de planta a planta, supresión del silenciamiento genético, transcripción inversa, integración en el cromosoma hospedador.
24. El proceso de la reivindicación 22 ó 23, donde dichos productos funcionan in trans.
25. El proceso como de la reivindicación 22 ó 23, donde dichos productos funcionan in cis.
26. El proceso de una de las reivindicaciones 1 a 25, donde uno de dichos replicones contiene un potenciador traduccional IRESmp75 unido operablemente a una secuencia heteróloga de ácido nucleico que codifica una proteína de interés.
27. Un proceso para generar amplificación y/o expresión de una o más secuencias de ácido nucleido de interés en una planta, tejido vegetal, célula vegetal o cultivo celular, caracterizado por que una célula vegetal se proporciona con un vector precursor diseñado para experimentar procesamiento en dicha célula, por lo que, debido a dicho procesamiento, se dota a dicha célula vegetal con por lo menos dos replicones capaces de replicación autónoma en dicha célula vegetal, donde dichos replicones
- (a) están relacionados estructuralmente entre si debido a dicho procesamiento;
- (b) son funcionalmente distintos entre si; y
- (c) proporcionan la amplificación y/o expresión.
28. El proceso de la reivindicación 27, donde el procesamiento del vector precursor es por la modificación de ARN.
29. El proceso para la producción de un producto bioquímico, que comprende la amplificación y/o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.
30. El proceso de la reivindicación 29, donde el producto bioquímico es una proteína, específicamente una proteína farmacéutica o un anticuerpo funcional.
31. Un proceso para la determinación de función de gen, que comprende amplificación y/o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.
32. Un proceso para evolución artificial o dirigida, que comprende amplificación o expresión de una o más secuencias de ácido nucleico de interés, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28.
33. Un proceso de transformación genética, que comprende la amplificación de una o más secuencias de ácido nucleico de interés, de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 28, seguido por la integración de dichas secuencias en el genoma de célula vegetal utilizando un proceso de integración basado en retrovirus o en retrotransposón.
34. Un sistema para causar la amplificación y/o expresión de un gen de interés en una célula vegetal, que comprende:
- - una construcción que contiene un promotor y un gen replicasa viral seguido por un sitio específico de recombinación y
- - un plásmido que se clona en un gen de interés fusionado con un sitio de recombinación, un 3'-UTR de un virus y una señal de terminación de trascripción,
donde una célula vegetal se proporciona con dicho constructo y dicho plásmido se dota de un replicón por la recombinación entre dicho constructo y dicho plásmido.
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