PROCESO PARA LA PREPARACION DE L-AMINOACIDOS QUE UTILIZA CEPAS DE LA FAMILIA ENTEROBACTERIACEAS.
Un proceso para la preparación de L-aminoácidos, seleccionados del grupo L-treonina,
L-homoserina, L-isoleucina, L-valina, L-metionina y L-lisina, en el cual se llevan a cabo los pasos siguientes:
a)fermentación de microorganismos del género Escherichia que producen dichos aminoácidos y en los que el o los genes ahpC y/o ahpF están sobreexpresados,
b)concentración del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP02/06560.
Solicitante: EVONIK DEGUSSA GMBH.
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: RELLINGHAUSER STRASSE 1-11,45128 ESSEN.
Inventor/es: RIEPING, MECHTHILD.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12P13/08 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.
Clasificación PCT:
- C12N9/02 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa.
- C12N9/08 C12N 9/00 […] › actúan sobre el peróxido de hidrógeno como aceptor (1.11).
- C12P13/08 C12P 13/00 […] › Lisina; Acido diaminopimélico; Treonina; Valina.
Clasificación antigua:
Fragmento de la descripción:
Proceso para la preparación de L-aminoácidos que utiliza cepas de la familia enterobacteriáceas.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a un proceso para la preparación de L-aminoácidos, seleccionados del grupo L-homoserina, L-isoleucina, L-valina, L-metionina, L-lisina y L-treonina, que utiliza cepas del género Escherichia en las que al menos uno o más de los genes seleccionados del grupo constituido por ahpC y ahpF están sobreexpresados.
Técnica anterior
Los L-aminoácidos, en particular L-treonina, se utilizan en medicina humana y en la industria de productos farmacéuticos, en la industria alimentaria y muy particularmente en nutrición animal.
Se conoce el modo de preparar L-aminoácidos por fermentación de cepas de Enterobacteriáceas, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Debido a su gran importancia, se están realizando continuamente trabajos a fin de mejorar los procesos de preparación. Las mejoras del proceso pueden estar relacionadas con medidas de fermentación, tales como v.g. agitación y suministro de oxígeno, o con la composición de los medios nutrientes, tales como v.g. la concentración de azúcar durante la fermentación, o con el tratamiento de la forma del producto, mediante v.g. cromatografía de intercambio iónico, o con las propiedades intrínsecas de rendimiento del microorganismo propiamente dicho.
Se utilizan métodos de mutagénesis, selección y selección de mutantes para mejorar las propiedades de producción de estos microorganismos. De esta manera se obtienen cepas que son resistentes a antimetabolitos, tales como v.g. el análogo de treonina ácido a-amino-ß-hidroxivalérico (AHV), o son auxótrofas para metabolitos de importancia reguladora y producen L-aminoácido, tales como v.g. L-treonina.
Se han empleado también desde hace varios años métodos de la técnica del DNA recombinante para mejorar la variedad de cepas de la familia Enterobacteriáceas que producen L-aminoácidos, por amplificación de los genes individuales de biosíntesis de aminoácidos e investigación del efecto sobre la producción.
Objeto de la invención
El objeto de la invención es proporcionar nuevas medidas para la preparación mejorada por fermentación de los L-aminoácidos que se definen posteriormente, en particular L-treonina.
Sumario de la invención
La invención proporciona un proceso para la preparación de los L-aminoácidos que se definen posteriormente, que utiliza microorganismos del género Escherichia que producen ya en particular dichos L-aminoácidos y en el cual al menos una o más de las secuencias de nucleótidos que codifican los genes ahpC y ahpF están sobreexpresadas.
Descripción detallada de la invención
En los casos en que se mencionan L-aminoácidos o aminoácidos como dichos aminoácidos en lo que sigue, esto significa uno o más aminoácidos, con inclusión de sus sales, seleccionados del grupo constituido por L-treonina, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-lisina y L-homoserina. Se prefiere particularmente L-treonina.
El término "intensificación" en este contexto describe el aumento en la actividad intracelular de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo que están codificadas por el DNA correspondiente, por ejemplo por aumento del número de copias del gen o genes, que utiliza un promotor potente o un gen o alelo que codifica una enzima o proteína correspondiente con actividad alta, y opcionalmente combinación de estas medidas.
Por medidas de intensificación, en particular sobreexpresión, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se incrementa en general al menos en un 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, hasta un máximo de 1000% o 2000%, basada en la de la proteína de tipo salvaje o la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida.
El proceso se caracteriza porque se llevan a cabo los pasos siguientes:
Los microorganismos que proporciona la presente invención pueden producir dichos L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa o a partir de glicerol y etanol. Dichos microorganismos son representativos de la familia Enterobacteriáceas seleccionados de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. Se prefieren los géneros Escherichia y Serratia. Del género Escherichia, deben mencionarse en particular las especies Escherichia coli y del género Serratia la especie Serratia marcescens.
Cepas adecuadas, que producen L-treonina en particular, del género Escherichia, en particular de la especie Escherichia coli, son, por ejemplo
Escherichia coli TF427
Escherichia coli H4578
Escherichia coli KY10935
Escherichia coli VNIIgenetika MG442
Escherichia coli VNIIgenetika Ml
Escherichia coli VNIIgenetika 472T23
Escherichia coli BKIIM B-3996
Escherichia coli kat 13
Escherichia coli KCCM-10132.
Cepas adecuadas productoras de L-treonina del género Serratia, en particular de la especie Serratia marcescens, son, por ejemplo
Serratia marcescens HNr21
Serratia marcescens TLr156
Serratia marcescens T2000.
Las cepas de la familia Enterobacteriáceas que producen L-treonina tienen preferiblemente, entre otras cosas, una o más características genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo constituido por: resistencia a ácido a-amino-ß-hidroxivalérico, resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a a-metilserina, resistencia a ácido diaminosuccínico, resistencia a ácido a-aminobutírico, resistencia a borrelidina, resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina, tales como, por ejemplo, hidroxamato de valina, resistencia a análogos de purina, tales como, por ejemplo, 6-dimetilaminopurina, una necesidad de L-metionina, opcionalmente una necesidad parcial y compensable de L-isoleucina, una necesidad de ácido meso-diaminopimélico, auxotrofia con respecto a dipéptidos que contienen treonina, resistencia a L-treonina, resistencia a L-homoserina, resistencia a L-lisina, resistencia a L-metionina, resistencia a ácido L-glutámico, resistencia a L-aspartato, resistencia a L-leucina, resistencia a L-fenilalanina, resistencia a L-serina, resistencia a L-cisteína, resistencia a L-valina, sensibilidad a fluoropiruvato, treonina-deshidrogenasa deficiente, opcionalmente capacidad para utilización de sacarosa, intensificación del operón treonina, mejora de la homoserina-deshidrogenasa I-aspartato-quinasa I, preferiblemente de la forma resistente a la realimentación, intensificación de la homoserina-quinasa, intensificación de la treonina-sintasa, intensificación de la aspartato-quinasa, opcionalmente de la forma resistente a la realimentación, intensificación de la aspartato-semialdehido-deshidrogenasa, intensificación de la fosfoenol-piruvato-carboxilasa, opcionalmente de la forma resistente a la realimentación, intensificación de la fosfoenol-piruvato-sintasa, intensificación de la transhidrogenasa, intensificación del producto del gen RhtB, intensificación del producto del gen RhtC, intensificación del producto del gen YfiK, intensificación de una piruvato-carboxilasa, y atenuación de la formación de ácido acético.
Se ha encontrado que los microorganismos del género Escherichia producen dichos L-aminoácidos, en particular L-treonina, de forma mejorada después de la sobreexpresión, de al menos uno o más de los genes seleccionados del grupo constituido por ahpC y ahpF.
Por regla general se prefiere el uso de genes endógenos. "Genes endógenos" o "secuencias de nucleótidos endógenas" deben entenderse con el significado de los genes o secuencias de nucleótidos presentes en la población de una especie.
Reivindicaciones:
1. Un proceso para la preparación de L-aminoácidos, seleccionados del grupo L-treonina, L-homoserina, L-isoleucina, L-valina, L-metionina y L-lisina, en el cual se llevan a cabo los pasos siguientes:
2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se aíslan dichos -aminoácidos.
3. Proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que los constituyentes de la fermentación y/o de la biomasa permanecen completamente o en porciones (
4. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que aumenta la expresión de uno o más polinucleótidos que codifican los productos génicos de los genes ahpC o ahpF.
5. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la sobreexpresión se consigue aumentando el número de copias de dichos genes.
6. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual microorganismos del género Escherichia se fermentan, en el cual se sobreexpresan adicionalmente al mismo tiempo uno o más de los genes seleccionados del grupo constituido por:
7. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual para la preparación de L-aminoácidos microorganismos del género Escherichia se fermentan, en el cual se atenúan, en particular se eliminan, adicionalmente al mismo tiempo uno o más de los genes seleccionados del grupo constituido por:
8. Microorganismos del género Escherichia, que producen L-aminoácidos, seleccionados del grupo L-treonina, L-valina, L-metionina, L-homoserina, L-isoleucina y L-lisina, en los que los genes ahpC y/o ahpF, y uno o más de los genes de acuerdo con la reivindicación 6, se sobreexpresan aumentando el número de copias de dichos genes.
9. Microoganismos de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual los microorganismos proceden de la especie E. coli.
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