Un proceso para la preparación de L-aminoácidos seleccionados a partir del grupo que consiste en L-treonina,

L-lisina y L-valina, donde los pasos siguientes son llevados a cabo:

a) fermentación de microorganismos de la familia Enterobacteriaceae que producen el L-aminoácido deseado y en el que el gen fba de Escherichia coli está sobre-expresado, donde la sobreexpresión se logra aumentando el número de copias del gen o colocando dicho gen bajo un promotor fuerte,

b) concentración del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos, y

c) aislamiento del L-aminoácido deseado, constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o porciones (> 0 a 100%) de las mismas que permanecen opcionalmente en el producto

Proceso para la preparación de L-aminoácidos usando cepas de la familia Enterobacteriaceae con sobreexpresión fba.

Campo de la invención

Esta invención se relaciona con un proceso para la preparación de L-aminoácidos, en particular L-treonina, usando cepas de la familia Enterobacteriaceae en la que al menos el gen fba está sobreexpresado.

Arte anterior

Los L-aminoácidos, en particular L-treonina, son usados en la medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria de la alimentación y muy particularmente en la nutrición animal.

Es conocido preparar L-aminoácidos por fermentación de las cepas de Enterobacteriaceae, en particular Escherichia coli (E. Coli) y Serratia marcescens. Debido a su gran importancia, se experimenta constantemente para mejorar los procesos de preparación. El mejoramiento del proceso puede relacionarse con medidas de fermentación, tales como por ejemplo agitación y suministro de oxígeno, o la composición del medio nutriente, tales como por ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación, o la preparación de la forma de producto, por ejemplo cromatografía de intercambio iónico, o propiedades de rendimiento intrínseco del propio microorganismo.

Los métodos de mutagénesis, selección y selección de mutante son usados para mejorar las propiedades de rendimiento de éstos microorganismos. Las cepas que son resistentes a los antimetabolitos, son obtenidas de esta manera tales como por ejemplo el análogo de treonina ácido a-amino-ß-hidroxivalérico (AHV), o son autotróficos para los metabolitos de importancia regulatoria y produce L-aminoácido, tal como por ejemplo L-treonina.

Los métodos de la técnica de ADN recombinante han sido también empleados durante algunos años para mejorar la cepa de las cepas de la familia de Enterobacteriacea que produce L-aminoácidos, amplificando genes individuales de la biosíntesis de aminoácidos e investigando el efecto en la producción.

Objeto de la invención

El objeto de la invención es proporcionar nuevas medidas para la preparación fermentativa mejorada de L-aminoácidos, en particular de L-treonina.

Descripción de la invención

La invención proporciona un proceso para la preparación de L-aminoácidos, en particular de L-treonina, usando microorganismos de la familia Enterobacteriacea que en particular ya producen L-aminoácidos y en que la secuencia nucleotídica que codifica para el gen fba está incrementado.

Donde los L-aminoácidos o aminoácidos son mencionados en lo que sigue, esto significa uno o más aminoácidos, que incluyen sus sales, seleccionados del grupo que consiste en L-treonina, L-valina, y L-lisina. L-treonina es particularmente preferido.

El término "incremento" en este contexto describe el aumento en la actividad intracelular de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo que están codificadas por el correspondiente ADN, por ejemplo aumentando el número de copias de el gen o genes, usando un potente promotor o un gen o alelo que codifica para una correspondiente enzima o proteína con una alta actividad, y opcionalmente combinando estas medidas.

Mediante las medidas de incremento, en particular la sobre-expresión, la actividad o concentración de la correspondiente proteína es en general aumentada en al menos l0%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ó 500%, hasta un máximo de 1000% ó 2000%, basado en la proteína del tipo-salvaje o la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida.

El proceso para la preparación de L-aminoácidos seleccionados a partir del grupo que consiste en L-treonina, L-lisina y L-valina se caracteriza porque los pasos siguientes son llevados a cabo:

Los microorganismos que proporciona la presente invención pueden producir los L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa o de glicerol y etanol. Estos son representativos de la familia de Enterobacteriacea seleccionados a partir del género de Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. Los géneros Escherichia, y Serratia son preferidos. Del género Escherichia las especies Escherichia coli y del género Serratia las especies Serratia marcescens serán mencionadas en particular.

Las cepas apropiadas, que producen L-treonina en particular, del género Escherichia, en particular de las especies Escherichia coli, son, por ejemplo

Las cepas apropiadas que producen L-treonina del género Serratia, en particular de las especies Serratia marcenscens, son, por ejemplo

Las cepas de la familia Enterobacteriaceae que producen L-treonina tienen preferentemente, entre otras, una o más características genéticas o fenotípicas seleccionadas a partir del grupo que consiste en: resistencia al ácido a-amino-ß-hidroxivalérico, resistencia a la tialisina, resistencia a etionina, resistencia a a-metilserina, resistencia al ácido diaminosuccínico, resistencia al ácido a-aminobutírico, resistencia a la borrelidina, resistencia al rifampicina, resistencia a los análogos de valina, tales como, por ejemplo, el hidroxamato de valina, resistencia a los análogos de purina, tales como, por ejemplo, 6-dimetilaminopurina, una necesidad para L-metionina, opcionalmente una necesidad parcial y compensable para L-isoleucina, una necesidad para el ácido meso-diaminopimélico, autotropía con respecto a los dipéptidos que contienen treonina, resistencia a L-treonina, resistencia a L-homoserina, resistencia a L-lisina, resistencia a L-metionina, resistencia al ácido de L-glutámico, resistencia a L-aspartato, resistencia a L-leucina, resistencia a L-fenilalanina, resistencia a L-serina, resistencia a L-cisteína, resistencia a L-valina, sensibilidad al fluoropiruvato, treonina dehidrogenasa defectivo, opcionalmente una habilidad para la utilización de sacarosa, incremento del operón treonina, incremento de la homoserina dehidrogenasa I-aspartato quinasa I, preferiblemente la forma resistente a la retroalimentación, incremento de la homoserina quinasa, incremento de la treonina sintasa, incremento de la aspartato quinasa, opcionalmente de la forma resistente a la retroalimentación, incremento de aspartato semialdehído dehidrogenasa, incremento del fosfoenol piruvato carboxilasa, opcionalmente de la forma resistente a la retroalimentación, incremento de la fosfoenolpiruvato sintasa, incremento de la transhidrogenasa, incremento del producto del gen RhtB, incremento del producto del gen RhtC, incremento del producto del gen YfiK, incremento de la piruvato carboxilasa y atenuación de la formación de ácido acético.

Se ha encontrado que los microorganismos de la familia Enterobacteriaceae producen L-aminoácidos, en particular L-treonina, de una manera mejorada después de la sobreexpresión, del gen fba.

El uso de genes endógenos es en general preferido. "Genes endógenos" o "secuencias nucleotídicas endógenas" son entendidas como los genes o secuencias nucleotídicas presentes en la población de una especie.

Las secuencias nucleotídicas de los genes de Escherichia coli pertenecen al arte anterior y también pueden encontrarse en la secuencia genómica de Escherichia coli publicada por Blattner y otros (Science 277: 1453-1462 (1997)).

La información siguiente sobre el gen de fba es conocida, entre otros, a partir del arte anterior: