Un procedimiento para la reducción o eliminación de impurezas de proteínas de un lisado de Streptococcus pneumoniae celular que comprende polisacáridos del serotipo 3 comprendiendo las etapas de:

a) calentar dicho lisado a al menos 60ºC durante al menos 30 minutos para causar agregación y precipitación de proteínas, y

b) separar precipitantes a partir de dicho lisado;

en el que se produce un lisado que contiene polisacáridos del serotipo 3 sustancialmente purificados

Procedimientos mejorados para la separación de polisacáridos de Streptococcus pneumoniae de tipo 3.

Campo de la invención

La invención se refiere a procedimientos mejorados para la reducción o eliminación de impurezas proteicas de un lisado o centrifugado de Streptococcus pneumoniae celular que comprende polisacáridos del serotipo 3 que implican etapas de calentamiento o de ajuste de pH.

Antecedentes

En la preparación de vacunas pneumocócicas conjugadas multivalentes destinadas a la prevención de enfermedades invasivas causadas por el organismo Streptococcus pneumoniae (también conocido como pneumococo), se cultivan serotipos de Streptococcus pneumoniae para suministrar polisacáridos necesarios para producir la vacuna. Las células se cultivan en grandes fermentadores con lisis inducida al final de la fermentación por adición de deoxicolato de sodio (DOC) o un agente que lisa alterno. El caldo de lisado se cosecha después para purificación posterior y para la recuperación del polisacárido capsular que rodea las células bacterianas. Después de conjugación con una proteína transportadora, el polisacárido se incluye en el producto de vacuna final y confiere inmunidad en la población objetivo de la vacuna para los serotipos de Streptococcus pneumoniae seleccionados.

Aunque el lisado celular producido en este proceso contiene el polisacárido objetivo, contiene también cantidades grandes de restos celulares incluyendo DNA, RNA, proteínas y componentes de medios residuales. El procesamiento tradicional ha implicado una reducción de pH mínima del lisado a 6,6 por adición de ácido acético para ayudar a eliminar por precipitación el agente lisante y algunas de las impurezas. Este material se somete a centrifugación seguida por filtración para eliminar la mayoría de los sólidos por debajo de un tamaño nominal de 0,45 µm. Sin embargo, tales procedimientos de procesamiento tradicionales han mostrado reducción mínima en impurezas con la dificultad subsiguiente en retirar proteínas solubles para satisfacer las especificaciones de polisacáridos purificados.

En el documento US 2006/0228381 A1 se describe un proceso para reducir el contenido en proteínas preservando mientras el contenido en polisacáridos vasculares en un caldo de lisado de Streptococcus pneumoniae celular complejo antes de purificación fundamentalmente bajando el pH del lisado a menos de 5,5.

La alta carga de proteína soluble contaminante ha sido particularmente problemática en funcionamientos para ciertos serotipos. Algunos serotipos, en particular Streptococcus pneumoniae de Tipo 3, producen cadenas polisacarídicas grandes y viscosas (por ejemplo, para el Tipo 3, cadenas de glucosa/ácido glucurónico de 2-3 millones de Daltons) que se liberan en el medio de cultivo tras lisis celular. Su viscosidad ha hecho difícil filtrar después de centrifugación, y, en tales casos, la eliminación de proteínas a través del procedimiento de purificación ha sido insuficiente y ha conducido a fallos de funcionamiento.

De acuerdo con ello, se necesitan procedimientos mejorados para la eliminación de impurezas proteicas de los lisados de Streptococcus pneumoniae celulares complejos, en particular de lisados que comprenden polisacáridos de Streptococcus pneumoniae de Tipo 3.

Breve sumario de la invención

Se proporcionan procedimientos mejorados para la reducción o eliminación de impurezas proteicas a partir de un lisado o centrifugado de Streptococcus pneumoniae celular complejo que comprenda polisacáridos de Streptococcus pneumoniae del serotipo 3. En un procedimiento, un lisado de Streptococcus pneumoniae celular que comprende polisacáridos de Streptococcus pneumoniae del serotipo 3 se calienta durante un tiempo y a una temperatura suficiente para desnaturalizar proteínas presentes en el lisado y causar su agregación y precipitación. De acuerdo con ello, en una realización de la invención, el procedimiento comprende las etapas de: 1) calentar el lisado a al menos 60ºC durante al menos 30 minutos para causar agregación y precipitación de proteínas; y 2) separar precipitantes del lisado; donde se produce un lisado que contiene polisacáridos del serotipo 3 sustancialmente purificados. En una realización particular, el lisado se calienta a aproximadamente 60ºC hasta aproximadamente 70ºC durante aproximadamente 30 a aproximadamente 50 minutos. En otra realización particular, el lisado se calienta a aproximadamente 65ºC durante aproximadamente 40 minutos. En una realización adicional, la etapa de separación comprende filtrar el lisado para eliminar precipitantes usando un filtro de profundidad, particularmente un filtro de membrana de tamaño de poro de 0,45 µm. En otra realización, la etapa de separación comprende filtrar el lisado para eliminar precipitantes usando un filtro de profundidad. En otra realización particular, la etapa de separar precipitantes del lisado comprende centrifugar el lisado para eliminar precipitantes.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un procedimiento para reducir o retirar impurezas proteicas a partir de un lisado o centrifugado de Streptococcus pneumoniae celular que comprende polisacáridos del serotipo 3 comprendiendo una etapa que implica ajuste de pH del lisado o centrifugado. En esta realización, la etapa de ajuste de pH mejora filtrabilidad. En una realización particular, el pH del lisado o centrifugado se incrementa hasta al menos 8,0 antes de la filtración, particularmente a entre aproximadamente 8,0 a 8,4 antes de filtración, y más particularmente a aproximadamente 8,2 antes de la filtración. En una realización adicional, la etapa de filtración comprende filtrar el lisado o centrifugado usando un filtro de membrana, particularmente un filtro de membrana de tamaño de poro 0,45 µm. En otra realización, la etapa de filtración comprende filtrar el lisado o centrifugado usando un filtro de profundidad.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un procedimiento para reducir o eliminar impurezas de proteínas a partir de un lisado de Streptococcus pneumoniae celular que comprende polisacáridos del serotipo 3 comprendiendo una etapa de calentamiento de lisado combinada con una etapa que implica ajuste de pH del lisado o de un centrifugado producido por centrifugación del lisado. En esta realización, la etapa de ajuste de pH mejora la filtrabilidad. De acuerdo con ello, en una realización el procedimiento comprende las etapas de: 1) calentar el lisado a al menos 60ºC durante al menos 30 minutos para causar agregación y precipitación de proteínas; 2) centrifugar el lisado y separar proteínas precipitadas del lisado para producir un centrifugado; 3) incrementar el pH del centrifugado a al menos 8,0; y 4) filtrar el centrifugado; donde se produce un centrifugado que contiene polisacáridos del serotipo 3 sustancialmente purificados. En una realización particular, el lisado se calienta a aproximadamente 60ºC hasta aproximadamente 70ºC durante aproximadamente 30 a aproximadamente 50 minutos antes de centrifugación, más particularmente a aproximadamente 60ºC durante aproximadamente 40 minutos. En otra realización, el pH del centrifugado se incrementa a entre aproximadamente 8,0 a aproximadamente 8,4 antes de la filtración, más particularmente aproximadamente a 8,2. En una realización adicional, la etapa de filtración comprende filtrar el lisado para eliminar precipitantes usando un filtro de membrana, más particularmente un filtro de membrana de tamaño de poro de 0,45 µm. En otra realización, la etapa de filtración comprende filtrar el lisado para eliminar precipitantes usando un filtro de profundidad.

En otra realización de la presente invención, se proporciona un procedimiento para reducir o eliminar impurezas proteicas a partir de un lisado o centrifugado de de Streptococcus pneumoniae celular que comprende polisacáridos del serotipo 3 comprendiendo una etapa de ajuste de pH para causar agregación y precipitación de proteínas. En esta realización, el procedimiento comprende las etapas de: 1) bajar el pH de dicho lisado a aproximadamente 3,0 hasta aproximadamente 5,0 para causar agregación y precipitación de proteínas; 2) centrifugar el lisado y separar proteínas precipitadas a partir del lisado para producir un centrifugado; 3) incrementar el pH del centrifugado a al menos 8,0; y 4) filtrar el centrifugado, donde se produce un centrifugado que contiene polisacáridos del serotipo 3 sustancialmente purificados. En una realización particular, el pH del lisado se baja a aproximadamente...

1. Un procedimiento para la reducción o eliminación de impurezas de proteínas de un lisado de Streptococcus pneumoniae celular que comprende polisacáridos del serotipo 3 comprendiendo las etapas de:

a) calentar dicho lisado a al menos 60ºC durante al menos 30 minutos para causar agregación y precipitación de proteínas, y

b) separar precipitantes a partir de dicho lisado;

en el que se produce un lisado que contiene polisacáridos del serotipo 3 sustancialmente purificados.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa a) comprende calentar dicho lisado a aproximadamente 60ºC hasta aproximadamente 70ºC.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la etapa a) comprende calentar dicho lisado durante aproximadamente 30 a aproximadamente 50 minutos.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la etapa a) comprende calentar dicho lisado a aproximadamente 65ºC durante aproximadamente 40 minutos.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa b) comprende filtrar dicho lisado para eliminar los precipitantes de dicho lisado.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho lisado se filtra usando al menos un filtro seleccionado del grupo constituido por un filtro de membrana y un filtro de profundidad.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicho filtro de membrana es un filtro de membrana de tamaño de poro de 0,45 µm.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa b) comprende centrifugar dicho lisado para eliminar los precipitantes de dicho lisado.

9. Un procedimiento para la reducción o eliminación de impurezas de proteínas a partir de un lisado o centrifugado de Streptococcus pneumoniae celular que comprende polisacáridos del serotipo 3 comprendiendo las etapas de:

a) incrementar el pH de dicho lisado o centrifugado a al menos 8,0; y

b) filtrar dicho lisado o centrifugado;

en el que se produce un lisado o centrifugado que contiene polisacáridos del serotipo 3 sustancialmente purificados.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el pH de dicho lisado o centrifugado se incrementa a entre aproximadamente 8,0 hasta aproximadamente 8,4 antes de la filtración.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el pH de dicho lisado o centrifugado se incrementa a aproximadamente 8,2 antes de la filtración.

12. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho lisado se filtra usando al menos un filtro seleccionado de grupo constituido por un filtro de membrana y un filtro de profundidad.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicho filtro de membrana es un filtro de membrana de tamaño de poro de 0,45 µm.

14. Un procedimiento para la reducción o eliminación de impurezas proteicas de un lisado de Streptococcus pneumoniae celular que comprende polisacáridos del serotipo 3 comprendiendo las etapas de:

a) calentar dicho lisado a al menos 60ºC durante al menos 30 minutos para causar agregación y precipitación de proteínas;

b) centrifugar dicho lisado y separar proteínas precipitadas a partir de dicho lisado para producir un centrifugado;

c) incrementar el pH de dicho centrifugado a al menos 8,0; y

d) filtrar dicho centrifugado;

en el que se produce un centrifugado que contiene polisacáridos del serotipo 3 sustancialmente purificados.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la etapa a) comprende calentar dicho lisado a aproximadamente 60ºC hasta aproximadamente 70ºC.

16. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la etapa a) comprende calentar dicho lisado durante aproximadamente 30 a aproximadamente 50 minutos.

17. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la etapa a) comprende calentar dicho lisado a aproximadamente 60ºC durante aproximadamente 40 minutos.

18. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la etapa c) comprende incrementar el pH de dicho centrifugado a entre aproximadamente 8,0 a aproximadamente 8,4.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que la etapa c) comprende incrementar el pH de dicho centrifugado a aproximadamente 8,2.

20. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la etapa d) comprende filtrar dicho centrifugado usando al menos un filtro seleccionado del grupo constituido por un filtro de membrana y un filtro de profundidad.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que dicho filtro de membrana es un filtro de membrana de tamaño de poro de 0,45 µm.

22. Un procedimiento para la reducción o eliminación de impurezas proteicas de un lisado de Streptococcus pneumoniae celular que comprende polisacáridos del serotipo 3 comprendiendo las etapas de:

a) bajar el pH de dicho lisado a aproximadamente 3,0 a aproximadamente 5,0 para causar agregación y precipitación de proteínas;

b) centrifugar dicho lisado y separar proteínas precipitadas a partir de dicho lisado para producir un centrifugado;

c) incrementar el pH de dicho centrifugado a al menos 8,0; y

d) filtrar dicho centrifugado;

en el que se produce un centrifugado que contiene polisacáridos del serotipo 3 sustancialmente purificados.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que la etapa a) comprende bajar el pH de dicho lisado a aproximadamente 3,0 para causar agregación y precipitación de proteínas.

24. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que la etapa c) comprende incrementar el pH de dicho centrifugado a entre aproximadamente 8,0 a aproximadamente 8,4.

25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que la etapa c) comprende incrementar el pH de dicho centrifugado a aproximadamente 8,2.

26. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que dicho centrifugado se filtra usando al menos un filtro seleccionado del grupo constituido por un filtro de membrana y un filtro de profundidad.

27. El procedimiento de la reivindicación 26, en el que dicho filtro de membrana es un filtro de membrana de tamaño de poro de 0,45 µm.

28. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que la etapa a) comprende adicionalmente calentar dicho lisado a aproximadamente 60ºC durante al menos 30 minutos.

29. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que la etapa a) comprende adicionalmente calentar dicho lisado a aproximadamente 60ºC hasta aproximadamente 70ºC.

30. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que la etapa a) comprende calentar dicho lisado durante aproximadamente 30 a aproximadamente 50 minutos.

31. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que la etapa a) comprende adicionalmente calentar dicho lisado a aproximadamente 60ºC durante aproximadamente 40 minutos.