Procedimiento para separar tacrólimo de las impurezas que comprende:

a) cargar una mezcla compuesta de tacrólimo e impurezas en un lecho de adsorbente pretratado con iones plata, en el que el adsorbente es gel de ciano sílice; y

b) eluir la mezcla del lecho de resina adsorbente para separar el tacrólimo de las impurezas presentes en la mezcla

Procedimiento para purificar tacrólimo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la purificación de tacrólimo.

Antecedentes de la invención

El tacrólimo, [3S-[3R[E(1S,3S,4S)], 4S, 5R, 8S, 9E,12R, 14R, 15S, 16R, 18S, 19S, 26aR]]-5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,24,25,26,26a-hexadecahidro-5,19-dihidroxi-3-[2-(4-hidroxi-3-metoxiciclohexil)-1-metiletenil]-14,16-dimetoxi-4,10,12,18-tetrametil-8-(2-propenil)-15,19-epoxi-3H-pirido[2,1-c][1,4]oxaazaciclotricosina-1,7,20,21(4H,23H)-tetrona, monohidratado (conocido anteriormente como FK506), presenta un peso molecular de 822,05, la fórmula C₄₄N₆₉ NO₁₂H₂O, y la fórmula estructural

El tacrólimo es un macrólido inmunosupresor natural producido por Streptomyces tsukubaensis. Es comercializado bajo la denominación PROGRAF® por Fujisawa, y está disponible para administración oral en cápsulas (cápsulas de tacrólimo). El tacrólimo prolonga la supervivencia del hospedador y del injerto trasplantado en modelos de trasplante animal de hígado, riñón, corazón, médula ósea, intestino delgado y páncreas, pulmón y tráquea, piel, córnea y extremidades inhibiendo la activación de linfocitos T. En animales, se ha demostrado que el tacrólimo suprime alguna inmunidad humoral y, en mayor medida, las reacciones mediadas por células, tal como el rechace del alotrasplante, la hipersensibilidad de tipo retardado, la artritis inducida por colágeno, la encefalomielitis alérgica experimental y la enfermedad de injerto contra hospedador.

El tacrólimo fue descrito por primera vez en la patente US nº 4.894.366 y en la patente europea EP 0 184 162. Cuando se prepara tacrólimo, se obtienen también dos análogos de tacrólimo, que son impurezas: La ascomicina, que presenta la formula estructural

y el dihidrotacrólimo, que presenta la formula estructural

La separación del tacrólimo de estas impurezas por procedimientos convencionales, tales como cristalización, es difícil debido a la similitud estructural. Por consiguiente, se necesita una purificación por cromatografía en columna. La eficacia de la purificación puede mejorarse utilizando iones plata en la cromatografía en columna. Los iones plata interactúan con el doble enlace de la cadena lateral de alilo que está presente en el tacrólimo, pero que no está presente en la ascomicina y en el dihidrotacrólimo en los que la cadena lateral es un grupo alquilo. En la ascomicina la cadena lateral es un grupo etilo, y, en el dihidrotacrólimo, la cadena lateral es un grupo propilo. Como resultado, el enlace entre el tacrólimo y la fase estacionaria o con la fase móvil está reforzado, y, de este modo, la diferencia en el tiempo de la retención del tacrólimo comparado con el tiempo de retención de sus análogos aumenta.

La patente US nº 6.492.513 da a conocer la separación del tacrólimo de sus impurezas utilizando una resina de intercambio catiónico fuerte pretratada con iones plata que contiene grupos de ácido sulfónico, y un eluyente de acetona o acetato de etilo y metanol. Como el tacrólimo es sensible a la resina de intercambio expuesta, cabría esperar la contaminación del tacrólimo.

Las patentes US nº 6.576.135 y nº 6.881.341 dan a conocer un procedimiento de cromatografía en columna de dos etapas para la separación del tacrólimo de las impurezas, particularmente del análogo tacrólimo-desmetil. Una etapa dada a conocer implica la adsorción de una mezcla que contiene tacrólimo en una resina de adsorción no iónica, y la emulsión con disolvente acuoso que contiene iones plata. La otra etapa dada a conocer implica la adsorción de la mezcla en una alúmina básica activa y la elución con un disolvente orgánico para realizar la separación. La utilización de agua en el eluyente da como resultado la formación de isómeros de tacrólimo, contaminando con ello el tacrólimo. Además, la utilización de un eluyente que contiene iones plata libres requiere la separación de los iones de plata del eluyente en el tacrólimo después de la elución de la columna.

La publicación de la solicitud de patente internacional WO 05/054253 da a conocer la separación cromatográfica de tacrólimo utilizando gel de sílice, opcionalmente, ya sea en cromatografía en fase inversa o pretratado con plata, después del tratamiento con gas amoniaco para eliminar las impurezas. El eluyente dado a conocer era una mezcla de n-butanol, acetonitrilo y un tampón para la separación en fase inversa, y una mezcla de acetato de etilo y hexano para la separación en gel de sílice tratada con plata.

La publicación de la solicitud de patente internacional WO 05/098011 da a conocer una separación de tacrólimo de las impurezas por cromatografía en gel de sílice, donde el gel de sílice se pretrata opcionalmente con plata. Opcionalmente, el tacrólimo se purifica más por cromatografía en fase inversa utilizando sílice sin tratar. Para la cromatografía en fase inversa se ilustra una columna C-8. Los eluyentes presentados incluyen acetato de etilo en hexano para la columna tratada con plata y una mezcla de acetonitrilo, n-butanol y tampón para la separación en fase inversa.

La publicación de la solicitud de patente internacional WO 05/010015 da a conocer la separación utilizando una resina de absorción no iónica sin plata y con un eluyente que contiene THF o acetonitrilo, agua, y, opcionalmente, un disolvente orgánico adicional.

Resulta necesario en la técnica un procedimiento para purificar el tacrólimo, particularmente de ascomicina y de dihidrotacrólimo que sería adecuado para su utilización a escala industrial. La presente invención proporciona dicho procedimiento.

Sumario de la invención

En una forma de realización la presente invención proporciona un procedimiento para separar tacrólimo de las impurezas que comprende: a) cargar una mezcla compuesta por tacrólimo e impurezas en un lecho de adsorbente pretratado con iones plata, en la que el adsorbente es gel de ciano sílice; y b) eluir la mezcla procedente del lecho de resina adsorbente para separar el tacrólimo de las impurezas presentes en la mezcla.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 presenta el análisis de HPLC de las fracciones cromatográficas (mg/l) según el ejemplo 2.

La figura 2 presenta el análisis de HPLC de las fracciones cromatográficas (mg/l) según el ejemplo 5.

La figura 3 presenta el análisis de HPLC de las fracciones cromatográficas (mg/l) según el ejemplo 21.

La figura 4 presenta el análisis de HPLC de las fracciones cromatográficas (mg/l) según el ejemplo 25.

La figura 5 presenta el análisis de HPLC de las fracciones cromatográficas (mg/l) según el ejemplo comparativo 23.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la purificación cromatográfica de tacrólimo utilizando un adsorbente pretratado con iones plata para la fase estacionaria ("adsorbente modificado con plata"), en el que el adsorbente es gel de ciano sílice. El procedimiento de la invención es particularmente útil para la separación de tacrólimo de la ascomicina y del dihidrotacrólimo.

El procedimiento de la invención es adecuado para su utilización industrial. Puede llevarse a cabo con un eluyente que no contiene agua ni/o iones plata, y proporciona una separación más eficaz del tacrólimo del dihidrotacrólimo y la ascomicina. Un eluyente que no contiene agua evita la contaminación del tacrólimo facilitando la formación de sus isómeros. Además, evitando la utilización de iones plata en el eluyente, la contaminación del producto final con iones plata se reduce sustancialmente. La utilización de una resina ácida fuerte, a la que el tacrólimo es sensible, y la utilización de la cromatografía en dos etapas, puede evitarse también en el procedimiento de la presente invención.

El tacrólimo, que está presente en una mezcla con impurezas, se carga en el adsorbente modificado con plata. La carga puede realizarse, por ejemplo, disolviendo...

1. Procedimiento para separar tacrólimo de las impurezas que comprende:

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la mezcla se eluye con un eluyente anhidro, en el que el eluyente anhidro presenta preferentemente menos de aproximadamente 2% de agua en volumen.

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que las impurezas son la ascomicina y el dihidrotacrólimo.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el eluyente anhidro se selecciona de entre el grupo constituido por disolventes orgánicos polares y mezclas de disolventes orgánicos polares y disolventes orgánicos apolares.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el disolvente orgánico polar se selecciona de entre el grupo constituido por cetonas C_3-9 lineales o ramificadas, ésteres C_3-7 lineales o ramificados, alcoholes C_1-7 lineales o ramificados, éteres C_2-8 lineales, ramificados o cíclicos, nitrilos C_2-5 y mezclas de los mismos.

6. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el disolvente orgánico polar se selecciona de entre el grupo constituido por hidrocarburo C_5-8 lineal, ramificado o cíclico, hidrocarburo aromático C_6-10 y mezclas de los mismos.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que el eluyente se selecciona de entre el grupo constituido por acetona, metiletil-cetona, metilisobutil-cetona, acetato de etilo, acetato de n-propilo, acetato de isopropilo, acetato de n-butilo, propionato de etilo, metanol, etanol, isopropanol, n-propanol, n-butanol, isobutanol, éter terc-butilmetílico, éter dietílico, éter diisopropílico, tetrahidrofurano acetonitrilo, tolueno, y hexano lineal, ramificado o cíclico, heptano, octano, ciclohexano y cicloheptano.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el eluyente anhidro comprende acetona, hexano o acetato de etilo.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el eluyente anhidro comprende acetona y hexano, en el que la acetona y el hexano están presentes en una relación de acetona a hexano de aproximadamente 1:1, aproximadamente 2:3, aproximadamente 1:4 o aproximadamente 1:9.

10. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el eluyente es una mezcla de acetona y acetato de etilo, y la acetona y el acetato de etilo están presentes en aproximadamente 50-80% de acetona por volumen comparada con el acetato de etilo.

11. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el eluyente anhidro es la acetona.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en el que el tacrólimo se eluye con una elución por gradiente, comenzando la elución con una mezcla de disolventes, seguida de la elución con aproximadamente 100 por cien de un solo disolvente, preferentemente en el que la elución por gradiente comprende comenzar la elución con una mezcla que comprende acetona y hexano, seguida de la elución con acetona.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la acetona y el hexano están presentes en una relación de acetona a hexano de aproximadamente 3:2 v/v.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la mezcla se eluye con una elución por gradiente con una columna de aproximadamente 10 cm o menos de longitud.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que la mezcla se eluye sin una elución por gradiente con una columna de por lo menos aproximadamente 1 m de longitud.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el procedimiento comprende rellenar una columna con el adsorbente modificado con plata, lavar el adsorbente modificado con plata con un eluyente, cargar una solución de tacrólimo en el eluyente en la columna y eluir el tacrólimo, la ascomicina y el dihidrotacrólimo de la columna.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que por lo menos uno de entre la ascomicina y el dihidrotacrólimo se eluye de la columna antes que el tacrólimo.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el tacrólimo antes de la separación comprende hasta aproximadamente 10 por ciento de área por HPLC de ascomicina y/o hasta aproximadamente 6 por ciento de área por HPLC de dihidrotacrólimo.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el adsorbente presenta una superficie específica de por lo menos aproximadamente 50 m²/g.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende además preparar el adsorbente modificado con plata en un procedimiento que comprende mezclar el adsorbente, una fuente de cationes de plata, y un disolvente seleccionado de entre el grupo constituido por uno o más alcoholes C_1-4, agua y una mezcla de agua y un disolvente miscible en agua, y secar.

21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el gel de ciano sílice comprende un gel de sílice unido de manera covalente en su superficie al grupo cianoalquilo.

22. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que el disolvente es un alcohol C_1-4, y la fuente de catión plata y el alcohol C_1-4 se combinan para formar una solución, y el adsorbente se añade a continuación para formar una suspensión, y preferentemente en el que el alcohol C_1-4 es el metanol.

23. Procedimiento según la reivindicación 21, en el que el disolvente es un alcohol C_1-4, y la fuente de ión plata y el alcohol C_1-4 se calientan a aproximadamente la temperatura de reflujo del disolvente para obtener una solución.

24. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que el disolvente es agua o una mezcla de agua y un disolvente miscible en agua, el adsorbente es un gel de sílice en fase inversa, la fuente de ión plata se disuelve a temperatura ambiente, y, antes del secado, se añade una solución de amoniaco a la solución de disolvente y fuente de catión plata.

25. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que la fuente de cationes plata es una solución de una sal de plata o de un complejo de plata, y preferentemente en el que la fuente de cationes plata comprende por lo menos uno de entre nitrato de plata y acetato de plata.

26. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que la fuente de cationes plata se selecciona de entre el grupo constituido por nitrato de plata, acetato de plata, sulfato de plata, un complejo plata ciano y un complejo de tiosulfato de plata.

27. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que la fuente de cationes plata comprende un complejo de plata ciano.

28. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que el adsorbente modificado con plata, después del secado, comprende aproximadamente 0,1 a aproximadamente 15 por ciento p/p de sal de plata.

29. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en el que el tacrólimo separado comprende por lo menos aproximadamente 93 por ciento de área por HPLC del tacrólimo.

30. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en el que el tacrólimo separado comprende menos de aproximadamente 0,20 por ciento de área por HPLC de ascomicina.

31. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en el que el tacrólimo separado comprende menos de aproximadamente 0,04 por ciento de área por HPLC de dihidrotacrólimo.

32. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, que comprende además separar cualesquier iones de plata eluidos con el tacrólimo procedentes del tacrólimo.

33. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, que comprende evaporar el eluyente para obtener un residuo, disolver el residuo en un disolvente orgánico, mezclar la solución resultante con una solución que comprende un reactivo que precipita iones plata, y filtrar la sal de plata precipitada, en el que el disolvente orgánico es preferentemente seleccionado de entre un grupo constituido por: acetato de etilo, tolueno, acetato isopropilo o normal, acetato de n-butilo, acetato de isobutilo, acetona, metiletil-cetona, metilisobutil-cetona, etanol, propanol, n-butanol, isobutanol, mezclas de acetato de etilo y acetona, mezclas de tolueno y acetona y mezcla de los mismos con agua, y más preferentemente en el que el disolvente orgánico es el acetato de etilo.

34. Procedimiento según la reivindicación 33, en el que el reactivo comprende un contraión seleccionado de entre un grupo constituido por acetato, sulfato, nitrito, bromato, salicilato, yodato, cromato, carbonato, citrato, fosfato, cloruro, estearato, sulfuro, bromuro, yoduro, cianuro, benzoato, oxalato, sulfito, y tiocianato, y preferentemente en el que el reactivo precipitante es NH₄Cl o cloruro de sodio.

35. Procedimiento según la reivindicación 33, que comprende además la adición del reactivo precipitante en una cantidad de 1 a aproximadamente 5 equivalentes molares por equivalente molar de plata.

36. Procedimiento según la reivindicación 33, en el que la solución comprende un reactivo que precipita iones plata en una solución acuosa.

37. Procedimiento según la reivindicación 33, que comprende pasar el eluido a través de una columna rellena con una mezcla de gel de sílice y un agente de precipitación.

38. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, que comprende además recoger por lo menos una fracción de efluente que presenta tacrólimo.

39. Procedimiento según la reivindicación 38, que comprende además la cristalización del tacrólimo separado.