Péptido aislado, donde el péptido comprende dos dominios a-helicoidales anfipáticos y en donde el péptido comprende una secuencia de aminoácidos tal y como se establece en cualquiera de los números de SEQ ID: 3-45

Péptidos con múltiples dominios a-helicoidales anfipáticos y procedimientos para su uso.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a péptidos con múltiples dominios a-helicoidales anfipáticos que estimulan el eflujo de lípidos de las células a través de una vía dependiente de ABCA1.

Los péptidos multi-dominio a-helicoidales anfipáticos que estimulan el eflujo de lípidos de las células a través de una vía dependiente de ABCA1 son útiles en el tratamiento y prevención de las dislipidemias y enfermedades vasculares.

Antecedentes

La eliminación del exceso de colesterol de las células por lipoproteínas de alta densidad (HDL) es favorecida por la apolipoproteína con sitios de unión en la superficie celular o por los receptores (Méndez et al, J. Clin. Invest. 94:1698-1705, 1994), como ABCA1 (Oram y Yokoyama, J. Res lípidos. 37:247 3-2491, 1996). ABCA1 es un miembro de la familia de transportadores de casete de unión ATP (Dean y Chimini., J. Res lípidos. 42:1007-1017, 2001) y se expresa en muchos tipos de células (Langmann et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 257:29-33, 1999). Las mutaciones en el transportador ABCA1 conducen a la enfermedad de Tánger, que se caracteriza por la acumulación de exceso de colesterol celular, los niveles bajos de colesterol HDL y un riesgo incrementado de enfermedad cardiovascular (Rust et al., Nat. Genet 22:352-355, 1999; Bodzioch et al., Nat. Genet. 22:347-351, 1999; Brooks-Wilson et al., Nat. Genet. 22:336-345, 1999; Remaley et al., Proc. Natl. Acad. SCI. EE.UU. 96:12685-12690, 1999, y Lawn et al., J. Clin. Invest. 104: R25-R31, 1999). Los fibroblastos de los pacientes con enfermedad de Tánger son defectuosos en la etapa inicial del eflujo de colesterol y fosfolípidos a las apolipoproteínas extracelulares (Francis et al., J. Clin. Invest. 96:78-87, 1995 y Remaley et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17:1813-1821, 1997).

La investigación ha demostrado una correlación inversa entre la existencia de los desencadenantes de aterosclerosis y los niveles de HDL y su componente de proteína más abundante, la apolipoproteína AI (apoA-I) (Panagotopulos et al., J. Biol. Chem. 277:39477-39484, 2002). La apoA-I ha demostrado estimular el eflujo de lípidos de las células transfectadas ABCA1 (Wang et al., J. Biol. Chem. 275:33053-33058, 2000; Hamon et al., Nat. Cell Biol. 2:399-406, 2000, y Remaley et al., Biochem. Biophys. Res. Commun 280:818-823, 2001). Sin embargo, la naturaleza de la interacción entre la apoA-I y ABCA1 no se entiende completamente. Muchas otras apolipoproteínas de tipo intercambiable también han demostrado que efluyen los lípidos de las células transfectadas ABCA1 (Remaley et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 280:818-823, 2001). A pesar de las apolipoproteínas de tipo intercambiable no comparten una secuencia de aminoácidos primaria similar, contienen hélices anfipáticas, un motivo estructural conocido para facilitar la interacción de las proteínas con los lípidos (Segrest et al., J. Res lípidos. 33:141-166, 1992 y Anantharamaiah et al., J. Biol. Chem. 260:10248-10255, 1985). Los experimentos con animales han demostrado que las inyecciones intravenosas de apoA-I o su variante, apoA-I Milano (que tiene una sustitución de cisteína en la posición 173 de arginina), produjo una regresión significativa de la aterosclerosis (Rubin et al., Nature 353:265-267, 1991 y Nissen et al. JAMA 290:2292-2300,2003). Estos resultados hacen la apoA-1 o sus derivados, atractivos como potenciales compuestos terapéuticos en el tratamiento y la prevención de la aterosclerosis.

Se han utilizado péptidos sintéticos cortos "gemelos" de las apolipoproteínas como modelo para el estudio de las propiedades biológicas y físicas ofapolipoproteínas (véase, por ejemplo, Fukushima et al., J. Am. Chem. Soc. 101:3703-3704, 1980; Kanellis et al., J. Biol. Chem. 255:11464-11472, 1980 y las patentes US Nº. 4.643.988 y 6.376.464). Estos incluyen, por ejemplo, hélices simples tomadas de las apolipoproteínas nativas, hélices alfa anfipáticas sintéticas (Kanellis et al., J. Biol. Chem. 255:11464-11472, 1980) y sus derivados. Ejemplos de péptidos sintéticos cortos helicoidales anfipáticos han demostrado estimular el eflujo de lípidos e inhibir la aterosclerosis (Garber et al, J. Res lípidos. 42:545-552, 2001; Navab et al., Circulación 105:290-292, 2002, y Patente US Nº 6.156.727). Sin embargo, mientras que algunos de estos péptidos muestran efectos beneficiosos en la prevención de la aterosclerosis, también son potencialmente citotóxicos (Remaley et al., J. Res lípidos. 44:828-836, 2003). Se cree que la citotoxicidad está provocada por el eflujo de lípidos independientes de ABCA1, no específicos, de las células (Remaley et al., J. Res lípidos. 44:828-836, 2003). Por lo tanto, existe la necesidad de un péptido sintético no citotóxico gemelo de las apolipoproteínas que estimule el eflujo de lípidos específico de las células por una ruta dependiente de ABCA1 para su utilización en el tratamiento y prevención de enfermedades cardiovasculares, como la aterosclerosis.

Descripción resumida de la invención

Se han identificado péptidos aislados y análogos del péptido incluyendo péptidos con múltiples dominios a-helicoidales anfipáticos que estimulan el eflujo de lípidos de las células a través de una vía dependiente de ABCA1 que se describen en este documento. El péptido multi-dominio incluye dos dominios a-helicoidales anfipáticos y el péptido comprende una secuencia de aminoácidos tal y como se define en cualquiera de los números de SEQ ID: 3-45.

Los péptidos pueden utilizarse en un procedimiento para el tratamiento de dislipidemias y enfermedades vasculares en un sujeto, incluida la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de los análogos del péptido o los péptidos multi-dominio aislados. La dislipidemia y desórdenes vasculares susceptibles de tratamiento con los péptidos aislados multi-dominio descritos en este documento incluyen, pero no se limitan a, la hiperlipidemia, hiperlipoproteinemia, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, deficiencia de HDL, deficiencia de apoA-I, enfermedad de las arterias coronarias, aterosclerosis, accidente cerebrovascular trombótico, enfermedad vascular periférica, reestenosis, síndrome coronario agudo, daño por reperfusión miocárdica, vasculitis, inflamación o combinaciones de dos o más de las mismas.

También se describe un procedimiento para la identificación de péptidos sustancialmente no citotóxicos, que estimulan el eflujo de lípidos dependiente de ABCA1 de las células, en el que se llevan a cabo pruebas de citotoxicidad con uno o más péptidos y se realizan pruebas de eflujo de uno o más lípidos en células que expresan ABCA1 y que no expresan ABCA1, de manera que se identifican uno o más péptidos sustancialmente no citotóxicos que estimulan el eflujo de lípidos dependiente de ABCA1 de las células. Ejemplos de dichos procedimientos incluyen péptidos que contienen dos o más dominios a-helicoidales anfipáticos.

Las características anteriores y otras ventajas se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de diferentes realizaciones que sigue con referencia a las siguientes figuras.

Breve descripción de las figuras

• Las Figuras 1A-1F son un conjunto de gráficos que ilustran el eflujo de lípidos por células transfectadas ABCA1 y células control tratadas con diferentes péptidos. Las células transfectadas ABCA1 (círculo cerrado) y las células control (círculo abierto) se cultivaron en un medio alfa-MEM con 10% de FCS y se examinó la capacidad de eflujo de colesterol (figuras 1A, 1C y 1E) y fosfolípidos (figuras 1B, 1D y 1F) durante 18 horas para apoA-I (figuras 1A y 1B), L-37pA (figuras 1C y 1D) y D-37pA (figuras 1E y 1F). Los resultados se expresan como la media de pm 1 por triplicado (desviación estándar).

• Las Figuras 2A-2B son un par de gráficos que ilustran la evolución en el tiempo del eflujo de lípidos por células transfectadas ABCA1 y células control tratadas con apoA-I y L-37pA. El eflujo de colesterol de cualquiera de las células transfectadas ABCA1 (Figura 2A) o células control (Figura 2B) tratadas con 10 µg/ml apoA-I (plaza), 10 µg/ml péptido L-37pA (triángulo) y el medio en blanco (círculo) (a-MEM, más 1 mg/ml BSA) se determinó en los puntos de tiempo indicados en el eje x. Los resultados se expresan como la media de pm 1 por triplicado (desviación...

1. Péptido aislado, donde el péptido comprende dos dominios a-helicoidales anfipáticos y en donde el péptido comprende una secuencia de aminoácidos tal y como se establece en cualquiera de los números de SEQ ID: 3-45.

2. Péptido aislado según la reivindicación 1 que estimula el eflujo de lípidos dependiente de ABCA1 de las células y es sustancialmente no citotóxico.

3. Péptido aislado según la reivindicación 2, que comprende además al menos un péptido de dominio adicional.

4. Péptido aislado según la reivindicación 3, donde el péptido de dominio adicional comprende un sitio de unión de heparina, un sitio de unión de las integrinas, un sitio de P-selectina, una secuencia TAT VIH, una secuencia de movimientos horizontales, una secuencia de penatratina, una secuencia SAA C-terminal, una secuencia SAA N-terminal, una secuencia del receptor de LDL, una secuencia 18A modificada, una secuencia de apoA-I Milano, una secuencia 6x-His, una secuencia de lactoferrina o combinaciones de dos o más de las mismas.

5. Molécula de ácido nucleico aislada que codifica para cualquiera de los péptidos según la reivindicación 1.

6. Composición farmacéutica, que comprende el péptido aislado según la reivindicación 2, o la molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 5 y un portador farmacéuticamente aceptable.

7. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, para su uso en un procedimiento para tratar o inhibir una dislipidemia o trastorno vascular en un sujeto.

8. Utilización de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento o la inhibición de una dislipidemia o trastorno vascular donde la dislipidemia o trastorno vascular comprende la hiperlipidemia, hiperlipoproteinemia, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, deficiencia de HDL, deficiencia de apoA-I, enfermedad de las arterias coronarias, aterosclerosis, accidente cerebrovascular trombótico, enfermedad vascular periférica, reestenosis, síndrome coronario agudo, lesiones post-perfusión del miocardio, vasculitis, inflamación o combinaciones de dos o más de las mismas.

9. Composición farmacéutica según la reivindicación 7, en donde la dislipidemia o trastorno vascular comprende la hiperlipidemia, hiperlipoproteinemia, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, deficiencia de HDL, deficiencia de apoA-I, enfermedad de las arterias coronarias, aterosclerosis, accidente cerebrovascular trombótico, enfermedad vascular periférica, reestenosis, síndrome coronario agudo, lesiones post-perfusión del miocárdico, vasculitis, inflamación o combinaciones de dos o más de las mismas.

10. Composición farmacéutica según la reivindicación 9 o utilización según la reivindicación 8, en donde la dislipidemia o trastorno vascular es la hipercolesterolemia.

11. Composición farmacéutica según la reivindicación 9 o la utilización según la reivindicación 8, en donde la composición farmacéutica o medicamento se administra en combinación con una composición adicional de disminución de lípidos.

12. Composición farmacéutica según la reivindicación 7 o la utilización según la reivindicación 8, en donde la composición farmacéutica o medicamento se administra por implante.