OLIGONUCLEOTIDOS ESPECIFICOS PARA LA DETECCION, IDENTIFICACION Y CUANTIFICACION DE AISLADOS DE MYCOPLASMA AGALACTIAE.

Oligonucleótidos específicos para la detección, identificación y cuantificación de aislados de Mycoplasma agalactiae.

Los oligonucleótidos de la presente invención presentan una secuencia de nucleótidos que es específica para una región del gen p40 específica de la especie Mycoplasma agalactiae. Dichos oligonucleótidos actúan como cebadores y sonda, respectivamente, frente a la secuencia diana de dicho gen.

La detección, identificación y cuantificación de aislados de Mycoplasma agalactiae se lleva a cabo mediante la tecnología estándar de PCR en cualquiera de sus variantes conocidas, especialmente mediante el empleo de PCR a tiempo real mediante sondas tipo TaqMan, y se caracteriza porque para la amplificación de la región del gen p40 del aislado de Mycoplasma agalactiae a determinar se emplean dichos oligonucleótidos

Oligonucleótidos específicos para la detección, identificación y cuantificación de aislados de Mycoplasma agalactiae.

La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de los métodos analíticos y sus correspondientes reactivos para determinaciones microbiológicas. Más específicamente, la presente invención proporciona nuevos oligonucleótidos que han mostrado ser especialmente útiles para la detección, identificación y cuantificación de aislados de Mycoplasma agalactiae.

Estado de la técnica

Mycoplasma agalactiae es el agente principal de la agalaxia contagiosa en los pequeños rumiantes (DaMassa y cols. 1992. Mycoplasmas of goat and sheep. J Vet Diagn Invest 4: 101-113.). En ovejas, tanto en machos como en hembras, este síndrome es producido principalmente por Mycoplasma agalactiae subsp. agalactiae, pero otros Mycoplasmas también pueden estar implicados (M. capricolum subsp. capricolum, M. mycoides subsp. capri, M. mycoides subsp. mycoides LC, y M. putrefaciens. La agalaxia contagiosa de los pequeños rumiantes es un proceso infeccioso serio caracterizado por mastitis, artritis, queratoconjuntivitis, y ocasionalmente abortos (Nicolas, R.A.J Contagious agalactia. 2004. In: OIE manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees), vol 2, Paris, p. 607-614). Esta patología fue descrita por primera vez en 1.816 en Italia por Metaza, y desde 1.871 se la conoce como agalaxia contagiosa, nombre dado por Brusasco (Zavagli. 1951. L'agalaxie contagieuse des brebis et des chevres. Bull. Off. Int. Epizoot. 36: 336-362). Actualmente afecta a la mayoría de los países con una elevada producción de ovejas y cabras tanto en Europa como en Asia y África (Sarris. 1996. Contagious agalactia. In: Frey, J. and Sarris, K: Mycoplasmas of ruminants: pathogenicity, diagnostics, epidemiology and molecular genetics. EUR 16934, COST, European Commission, European Communities Official Publications Office, Luxembourg, 12-15), siendo endémica en la mayoría de los países mediterráneos, y afectando prácticamente a todo el territorio nacional (Gil y cols. 1999. Aetiology of caprine contagious agalactia syndrome in. Extremadura, Spain. The Vet. Rec. 144: 24-25). Las principales vías de transmisión son la ingestión de alimento, agua o leche contaminada, o a través de la orina, heces o líquidos nasales u oculares, pudiendo los animales con infecciones subclinicas o crónicas infectar durante meses. En el transcurso del proceso infeccioso, se aísla un gran número de gérmenes en leche y sangre durante un periodo breve de tiempo, lo que contribuye a aumentar el recuento somático, y de ahí éstos migran a otros órganos provocando en ocasiones una severa queratoconjuntivitis y artritis que puede involucrar a una o varias articulaciones. El agente sobrevive en los nódulos linfáticos supramamarios de una lactación a otra, lo que implica que el animal detectado portador debe sacrificarse. La mayoría de casos ocurren en verano, en épocas de parideras o durante el pico de lactación. El periodo de incubación de la enfermedad varía entre 7-56 días.

La agalaxia contagiosa no presenta una elevada mortalidad, 10-20%, sin embargo el porcentaje de afectación puede alcanzar hasta el 60% de los individuos de una granja debido a su elevada contagiosidad. Además, una de las manifestaciones más recurrentes es la reducción de la producción láctea, pudiendo incluso llegar a una completa supresión de la misma, así como la aparición de abortos en animales gestantes y en casos severos de enfermedad en granjas incluso producir la muerte de hasta el 70% de los animales jóvenes, lo que acarrea por tanto cuantiosas pérdidas económicas. En este sentido, se ha estimado que las pérdidas económicas por esta enfermedad en los países europeos de la cuenca mediterránea pueden superar los 90 millones de € anuales (Nicholas. 2002. Improvements in the diagnosis and control of diseases of small ruminants caused by mycoplasmas. Small Rumin Res 45, 145-149), superando en una única región como la Comunidad Autónoma de Extremadura los 5 millones de € anuales (Gil. 1997. Síndrome de Agalaxia Contagiosa Caprina en Extremadura: Aspectos etiológicos, clínicos y epidemiológicos. Tesis Doctoral. Universidad de Extremadura). Además, la enfermedad está ampliamente extendida en las exploraciones de ovino de leche españolas, llegándose a aislar Mycoplasma agalactiae en un 10% de muestras de mamitis subclínicas y en un 20% de las clínicas, mientras que en un estudio sobre 274 explotaciones de ovino de leche se aisló Mycoplasma agalactiae en una única muestra de leche de tanque en el 12% de los rebaños, y alcanzándose prevalencias de hasta el 25% en algunas explotaciones (Esnal, comunicación personal). Por lo tanto, debido a su elevado impacto económico y a su amplia distribución, esta enfermedad representa un problema muy serio de sanidad animal y está incluida en la lista de declaración obligatoria de la Oficina Internacional de Sanidad Animal (OIE).

El diagnóstico de M. agalactiae suele ser por microbiología clásica, basado en el aislamiento de este microorganismo en medios de cultivo específicos como por ejemplo el medio Hayflick modificado o comerciales, y posterior identificación con pruebas bioquímicas. Sin embargo el cultivo específico de este microorganismo presenta una serie de inconvenientes ya que es un proceso muy lento que requiere la incubación durante al menos siete días llegando incluso hasta las tres semanas (Damassa y cols. 1.992. Mycoplasmas of goats and sheep. J Vet Diagn Invest. 1992 Jan; 4(1):101-13). Asimismo, es un método caro ya que los medios específicos y el suplemento son costosos, y además ocasiona graves problemas de interpretación de los resultados puesto que aunque las colonias de este microorganismo presentan una forma característica de huevo frito, su identificación al microscopio es difícil y laboriosa debido a que las colonias son pequeñas y no permite su identificación a nivel de especie. Para tratar de solventar estos inconvenientes, se han desarrollado métodos inmunológicos basados en la técnica de ELISA (del inglés enzyme-linked innnunosorbent assay). Sin embargo, estos métodos pueden dar lugar a reacciones cruzadas con M. bovis, y con el "cluster mycoides" (Mattsson y cols. 1.994. The phylogeny of Mycoplasma bovis as determined by sequenceanalysis of the 16S rRNA gene. FEMS Microbiol. Lett. 115: 325-328), así como falsos negativos debido a la capacidad de M. agalactiae de modificar su superficie celular y por tanto de variar su capacidad antigénica, y a que la seroconversión se produce a partir de 28-35 días tras la infección.

También se han desarrollado métodos moleculares que permiten la identificación específica de este microorganismo. La mayoría de estos métodos se basan en la amplificación del gen ADN ribosomal 16S. Sin embargo la elección de este marcador molecular presenta una serie de desventajas, como una baja especificidad ya que las secuencias del gen ADN ribosomal 16S de M. agalactiae y Mycoplasma bovis son muy similares y existe una elevada variabilidad intraespecífica en M. agalactiae, y una falta de capacidad para la cuantificación ya que este gen se encuentra presente en un número indeterminado de copias en el genoma de M. agalactiae (Ross. 1.993. Mycoplasma-animal pathogens. In Rapid Diagnosis of Mycoplasmas ed. Kahane, I. and Adoni, A. New York: Plenum Press, pp 69-109). Otros sistemas desarrollados se basan en secuencias desconocidas de M. agalactiae, lo que puede favorecer la aparición de falsos negativos debido a que se desconoce el grado de conservación de las mismas. Recientemente se ha publicado un sistema de PCR a tiempo real basado en la amplificación del gen mp81 que codifica una proteína de superficie de membrana (Lorusso y cols. 2.007. A real-time PCR assay for detection and quantification of Mycoplasma agalactiae DNA. J Appl Microbiol. 103:918-923). Ese sistema utiliza la química molecular beacons, la cual es menos conveniente que la TaqMan. Además el sistema describe el rango de cuantificación utilizando un plásmido y no ADN genómico de M. agalactiae lo que puede provocar una subestimación de la concentración en la muestra. Por otro lado, aunque utiliza un control interno, necesario para comprobar el correcto funcionamiento de la reacción de amplificación, éste es usado en una reacción de PCR diferente, resultando por tanto inútil al no realizarse en el mismo tubo de reacción. Finalmente, la especificidad del sistema únicamente...

1. Oligonucleótidos caracterizados porque contienen una secuencia nucleotídica identificada como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.

2. Método para la detección, identificación y cuantificación de Mycoplasma agalactiae, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:

a) extracción del ADN de una muestra,

b) amplificación del ADN extraído en la etapa a) con los oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,

c) interpretación de los resultados.

3. Método según la reivindicación 2, donde después de la etapa b) de amplificación hay una etapa de detección del ADN amplificado en la etapa b) mediante el oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 3.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, donde el ADN amplificado corresponde con la región del gen p40 de Mycoplasma agalactiae.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 donde la amplificación se realiza mediante PCR.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 donde la amplificación se realiza mediante PCR en tiempo real.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, donde en la etapa a) de amplificación se utilizan los oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: l y SEQ ID NO: 2 como cebadores y el oligonucleótido identificado como SEQ ID NO: 3 como sonda.

8. Uso de los oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 para la identificación, detección y cuantificación de Mycoplasnia agalactiae.

9. Kit para la identificación, detección y cuantificación de Mycoplasma agalactiae según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 caracterizado porque comprende oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.