NUEVOS HONGOS ENDOFITOS Y PROCEDIMIENTOS DE USO.

Un procedimiento para identificar hongos Muscodor, que comprende poner en contacto una cantidad efectiva de los hongos que se van a someter a detección selectiva con volátiles de Muscodor albus o de Muscodor roseus en condiciones de cultivo,

seleccionar los hongos resistentes a los voláticles del Muscodor albus o de Muscodor roseus y analizar las características moleculares de los hongos seleccionados

Nuevos hongos endófitos y procedimientos de uso.

Campo de la invención

En la presente solicitud se refiere a un procedimiento para identificar hongos nuevos que producen antibióticos volátiles. Los compuestos volátiles tienen actividad biológica contra hongos y bacterias patógenos de plantas y seres humanos, insectos y nematodos.

Antecedentes de la invención

En la presente solicitud se hace referencia a varios artículos y libros citando el autor y la fecha. Las citas bibliográficas completas para cada publicación pueden encontrarse al final de la memoria, inmediatamente antes de las reivindicaciones.

Está reconocido que los hongos producen antibióticos que son útiles en el tratamiento de enfermedades, en aplicaciones industriales y como pesticidas, por ejemplo, penicilina, cefalosporinas, tetraciclina y ciclosporinas, ninguna de las cuales es volátil. Se conocen muchas especies de hongos que emiten bajas concentraciones de sustancias gaseosas, especialmente algunas que tienen olores repugnantes distintivos, y esto ha provocado análisis químicos de los volátiles fúngicos (Bjurman y col., 1992). Algunas de estas sustancias volátiles son comunes a muchos hongos, mientras que otras parecen ser únicas para una especie (Schnurer y col., 1999; Rapior y col., 2000). Dennis & Webster (1971) comunicaron que ciertas especies de Trichoderma producían antibióticos volátiles que inhibían el crecimiento de hongos de prueba tales como Rhizoctonia solani, Pythium ultimum y Fusarium oxysporum. Estos autores no comunicaron efectos letales para ninguno de los hongos de prueba y no se realizó un análisis químico exhaustivo de los componentes volátiles de los cultivos fúngicos, aunque se sugirió que el acetaldehído era uno de los volátiles. Por tanto, a pesar de cierta atención prestada a lo largo de los años a los compuestos volátiles de los cultivos fúngicos, no se ha comunicado ninguna mezcla letal de antimicrobianos volátiles producidos por hongos.

Es también bien conocido que varios microorganismos exhiben actividad biológica de modo que son útiles para el control de enfermedades de plantas. Aunque se han hecho progresos en el campo de la identificación y desarrollo de plaguicidas biológicos para controlar varias enfermedades de plantas de importancia en la agronomía y la horticultura, la mayoría de los plaguicidas en uso siguen siendo compuestos sintéticos. Muchos de estos fungicidas químicos son clasificados por la EPA como carcinógenos y son tóxicos para la fauna y flora silvestres y otras especies a las que no están dirigidos. Por ejemplo, el bromuro de metilo es ampliamente usado como fumigante de suelos y para tratar infecciones microbianas posteriores a la recolección. Debido a su alta toxicidad para seres humanos y animales y a su efecto nocivo para la atmósfera, el uso de bromuro de metilo va a ser eliminado pronto y existe la gran necesidad de encontrar sustitutos más seguros para este y otros plaguicidas sintéticos.

La presente invención satisface esta necesidad y también proporciona ventajas relacionadas.

Descripción detallada de la invención

Se proporciona un procedimiento para identificar hongos navel unicodor, incluidos los hongos truscodor albus y Muscodor roseus, en el que los hongos Muscodor producen una mezcla de antibióticos volátiles con actividad contra hongos, bacterias, insectos y nematodos. En un aspecto, el Muscodor es identificado empleando la información suministrada en la presente memoria descriptiva, que incluye, entre otras, secuencias genómicas parciales expuestas en las SEC ID Nº: 1 a 4. Dos nuevas cepas fueron depositadas en el NRRL el 1 de febrero de 2002 conforme a las condiciones establecidas en el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito de Procedimiento de Patentes con los nº de registro 30457 y 30458.

También se proporcionan composiciones que contienen los hongos y/o los compuestos volátiles. Las composiciones son útiles para el tratamiento de suelos y para proteger plantas, semillas, granos y frutas de hongos y bacterias patógenos. Las composiciones son también útiles para la protección de alimentos trás la recolección contra infecciones de hongos y bacterias. Las composiciones además son útiles para el tratamiento de desechos humanos o animales y para el tratamiento y/o la prevención de la infestación por el moho tóxico de edificaciones y materiales para construcción, tales como madera. También se proporcionan en la presente invención procedimientos no terapéuticos para el tratamiento y la protección de suelos, plantas, semillas, granos, productos de desecho, materiales de construcción y productos alimenticios tras la recolección contra infecciones bacterianas, por insectos, nematodos y fúngicas.

Breve descripción de las tablas

La Tabla 1 muestra los efectos de los compuestos volátiles de M. albus y de una mezcla artificial de compuestos de M. albus en un grupo de microbios de prueba. Después de la exposición a los gases de M. albus, el microbio de prueba fue evaluado para determinar su viabilidad después de la eliminación de los gases. La atmósfera artificial estaba constituida por los compuestos identificados después del análisis de los gases de M. albus. El crecimiento microbiano en la atmósfera artificial se midió después de la exposición a la mezcla artificial de compuestos a 3,2-90 µl/50 cc con el fin de obtener las CI₅₀. El % de crecimiento con respecto al control y la viabilidad se midieron después de la exposición a 60 µl/50 cc. La viabilidad se determinó a los 3 días después de la eliminación de los compuestos.

La Tabla 2 muestra el número promedio de brotes de brécol por maceta una semana después del plantado (medias ± desviación estándar) utilizando vermiculita. Se plantaron las macetas inmediatamente sin un periodo de incubación.

La Tabla 3 muestra los resultados de un experimento para determinar la capacidad de Muscodor albus para controlar el moho azul de las manzanas.

La Tabla 4 muestra los resultados de los análisis de CG/EM de los compuestos volátiles producidos por M. albus. Varios picos menores y el pico de gran avance fueron omitidos del análisis global debido a que representan únicamente el 1% del área total. Los compuestos encontrados en la placa control de PDA no se incluyen en esta tabla.

La Tabla 5 muestra los resultados de un ensayo para determinar la influencia inhibidora de cada clase de compuestos volátiles. Esto se expresa como el % de crecimiento del microbio de prueba en comparación con un control que no está en presencia de los compuestos de prueba. Los compuestos se analizaron durante una exposición de 2 días a las concentraciones relativas que se producen en M. albus a la concentración óptima de prueba de 60 µl/50 cc de volumen de aire o 1,2 µl/cc.

La Tabla 6 muestra los volátiles de Muscodor albus usados para el tratamiento de semillas de cebada infestadas con carbón cubierto. Grupos de semillas no tratadas y no infestadas se usaron como controles.

Modos de llevar a cabo la invención

A lo largo de esta divulgación se hace referencia a varias publicaciones, patentes y especificaciones de patentes publicadas mediante una cita que las identifica.

La puesta práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluidas técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, las cuales están dentro del conocimiento de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Estos procedimientos se describen en las siguientes publicaciones. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ª edición (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel y col., editores (1987)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); PCR: A PRACTICAL APPROACH (M. MacPherson y col., IRL Press en Oxford University Press (1991)); y PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames y G. R. Taylor, editores (1995)).

Definiciones

Las formas en singular "un", "una", "la" y "el" incluyen las referencias en plural a menos de que el contexto claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, incluyendo mezclas de las mismas.

El término "que comprende" tiene la intención de significar que las composiciones...

1. Un procedimiento para identificar hongos Muscodor, que comprende poner en contacto una cantidad efectiva de los hongos que se van a someter a detección selectiva con volátiles de Muscodor albus o de Muscodor roseus en condiciones de cultivo, seleccionar los hongos resistentes a los voláticles del Muscodor albus o de Muscodor roseus y analizar las características moleculares de los hongos seleccionados.

2. Un hongo Muscodor aislado que se puede obtener mediante el procedimiento definido en la reivindicación 1.

3. El hongo Muscodor aislado de la reivindicación 2, en el que el hongo se selecciona del grupo constituido por Muscodor albus, Muscodor roseus y mutantes de los mismos.

4. Una composición que comprende un hongo Muscodor aislado de acuerdo con las reivindicaciones 2 o 3.

5. Una composición que comprende todos los volátiles producidos por un hongo Muscodor aislado, en la que los volátiles comprenden octano, acetona, acetato de metilo, acetato de etilo, éter metílico de ácido 2-metil-propanoico, etanol, éster etílico de ácido 2-metil propanoico, éster de 2-metilpropílico de ácido 2-metil propanoico, alcohol isobutílico, 1-butanol-3-metil-acetato, éster 3-metilcutílico de ácido 2-metil-propanoico, 1-butanol-3-metilo, 2-pentil-furano, 4-nonanona, 2-nonanona, (4aR-trans)-dec-anhidro-4ª-metil-1-metilen-7-(1-metiletiliden)-naftaleno, 1,2,3,4,5,6,7,8-octahidro-1,4-dimetil-7-(1-metiletenil)-[1S-(1.alfa, 4-alfa, 7-alfa)]-azuleno, 4-(1,5-dimetil-1,4-hexadienil)-1-metil-ciclohexeno, 2,3,4,7,8,8a-hexahidro-3,6,8,8-tetrametil-[3R-(3.alfa, 3a-beta., 7.beta., 8a.alfa.)]-1H-3a, 7-metanoazuleno, ácido 2-metil-propanoico, cariofileno, 1,2,4a,5,6,8a-hexahidro-4,7-dimetil-1-(1-metiletil)-[1R-(1-alfa.,4a.alfa.,8a.alfa)]-naftaleno, 3,7,7-trimetil-11-metilen-espiro[5.5]undec-2-eno, 1,2,3,5,6,7,8,8a-octahidro-1,4-dimetil-7-(1-metiletilenil)-[1S-(1.alfa.,7.alfa.,8a.beta)]-azuleno, 1,2,3,5,6,7,8,8a-octahidro-1,8a-dimetil-7-(1-metilete- nil)-[1R-(1.alfa.,7.beta.,8a.alfa.)]-naftaleno, éster 2-feniletílico de ácido acético y alcohol feniletílico.

6. La composición de la reivindicación 4, que además comprende un vehículo.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que el vehículo es un vehículo aceptable para fines agrícolas.

8. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 4-7, que comprende además una cantidad efectiva para fines agrícolas de una composición seleccionada del grupo constituido por un funguicida, un insecticida, un antimicrobiano, un bactericida, un nematicida y un conservante de alimentos.

9. Un procedimiento no terapéutico para inhibir el crecimiento de un organismo seleccionado del grupo constituido por un hongo, una bacteria, un microorganismo, un nematodo y un insecto, que comprende exponer al organismo a una cantidad efectiva de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 4-7.

10. El procedimiento de la reivindicación 9 tratar o proteger frutas, plantas, semillas, granos o el suelo que rodea a las plantas de una infestación por un organismo seleccionado del grupo reconstituido por un hongo, una bacteria, un microorganismo, un nematodo y un insecto.

11. El procedimiento de la reivindicación 9 para tratar o proteger metarial de construcción de infestaciones por mohos tóxicos.

12. El procedimiento de la reivindicación 10, que comprende exponer las frutas, las plantas, las semillas, los granos o el suelo que rodea a las plantas a una cantidad eficaz de una composición agrícola seleccionada del grupo constituido por un funguicida, un insecticida, un antimicrobiano, un bactericida, un nematicida y un conservante alimenticio.

13. Un procedimiento para obtener una composición volátil de un hongo Muscodor aislado de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende cultivar el hongo Muscodor aislado y recolectar la composición volátil producida por el hongo en crecimiento.