NUEVAS ALCOHOL-DESHIDROGENASAS.

Un polipéptido que tiene la actividad biológica de una alcohol-deshidrogenasa dependiente de NAD o NADP,

y que comprende las secuencias siguientes: una secuencia que es idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 34

Nuevas alcohol-deshidrogenasas.

La invención se refiere a nuevos polipéptidos que tienen la actividad biológica de una alcohol-deshidrogenasa dependiente de NAD o NADP. La invención se refiere adicionalmente a ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos, a hospedadores o células hospedadoras no humanos(as) y a sistemas de reacción que pueden utilizarse para preparar productos deseados. Los polipéptidos de la invención se utilizan preferiblemente en la preparación, a partir de aldehídos o cetonas, de alcoholes primarios y alcoholes secundarios enantioméricamente puros que pueden servir como compuestos intermedios para medicamentos. Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden emplearse también en la reacción inversa, es decir, la oxidación de alcoholes con la formación de aldehídos o cetonas.

La descripción hace referencia a diversos documentos. El contenido de la descripción de estos documentos se incorpora por la presente por la referencia.

Los alcoholes enantioméricamente puros se encuentran entre los bloques de construcción quirales más importantes de la química industrial especial y fina. Estos productos actúan, entre otras cosas, como compuestos intermedios clave esenciales en la preparación de medicamentos. Durante largo tiempo, la ruta industrial para estas moléculas diana ha transcurrido preferiblemente por la vía de procesos puramente químicos, por ejemplo por resolución del racemato. Esto implica, a partir de una cetona, preparar primeramente el alcohol en su forma racémica y aislar luego el enantiómero deseado en una resolución del racemato con ayuda de al menos cantidades estequiométricas de una sustancia adyuvante quiral. Desventajas de estos métodos incluyen no sólo el rendimiento de 50% como máximo de la resolución del racemato, sino que deben considerarse también en el uso de numerosos compuestos de partida ecológicamente problemáticos para la preparación del racemato. Otras desventajas son el paso adicional de reciclado del enantiómero no deseado así como la necesidad de reactivos adyuvantes quirales (además, cantidades estequiométricas de los mismos) para la resolución del racemato. El concepto de la resolución del racemato se resume en la ecuación (1a) en la vista de conjunto de la Figura 1. Un primer progreso sustancial hacia un proceso más sostenible se consiguió utilizando la resolución biocatalítica del racemato, dispensando con ello la necesidad de emplear cantidades estequiométricas de reactivos adyuvantes quirales. Lamentablemente, sin embargo, todas las restantes desventajas arriba enumeradas siguen siendo relevantes, a pesar de dicha ruta biocatalítica.

Una posible vía de evitar las desventajas arriba descritas de la resolución del racemato o de síntesis diastereoselectivas es la conversión directa de cetonas en los alcoholes ópticamente activos deseados en un solo paso. Tales "procesos asimétricos directos" pueden llevarse a cabo utilizando primeramente quimio-catalizadores que contienen metales, siendo los quimiocatalizadores empleados complejos que contienen metales pesados que incluyen un ligando quiral. Además del uso de metales pesados ecológicamente problemáticos como componente sustancial del catalizador, es también desventajosa la necesidad de ligandos costosos y muy sensibles en parte, por ejemplo ligandos fosfano.

Otra alternativa consiste en la reducción asimétrica directa utilizando biocatalizadores adecuados para conversión cuantitativa de sustratos proquirales en el producto enantioméricamente puro deseado. También, en este caso, el número de pasos de reacción se reduce al mínimo teóricamente posible de un solo paso, llevándose a cabo la conversión biocatalítica en condiciones ecológicamente excelentes (entre otras, agua como disolvente), y el proceso como tal procede con alta economía atómica. El concepto de un proceso biocatalítico y sostenible de esta clase se expone en la ecuación (1b) de la vista de conjunto de la Figura 1.

Una desventaja de la variante biocatalítica, sin embargo, es la carencia de alcohol-deshidrogenasas disponibles en escala industrial como biocatalizadores adecuados para la reacción diana y la expresión de los mismos. El objeto en el que está basada la presente invención fue por tanto obtener nuevas alcohol-deshidrogenasas eficientes e industrialmente utilizables. Este objeto se consigue por las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Así pues, la presente invención se refiere a un polipéptido que tiene la actividad biológica de una alcohol-deshidrogenasa dependiente de NAD o NADP y que comprende la secuencia siguiente: una secuencia que es idéntica a la secuencia de SEQ ID No: 34.

La secuencia de aminoácidos mencionada y caracterizada por SEQ ID está codificada preferiblemente por las secuencias de DNA a que se hace referencia como SEQ ID Número 68. Se concede adicionalmente preferencia a polipéptidos que corresponden a las enzimas existentes naturalmente en toda su longitud. En otra realización preferida, los polipéptidos de la invención comprenden adicionalmente al menos una sección de aminoácidos heteróloga que caracteriza dichos polipéptidos como proteínas de fusión. Posibles ejemplos de componentes heterólogos de la proteína de fusión de la invención son marcadores (v.g. el marcador His o el marcador Flag) que pueden utilizarse para purificación de las proteínas de fusión de la invención. En otras realizaciones, los componentes heterólogos pueden tener su propia actividad enzimática. En tal caso, los dos componentes enzimáticos están enlazados preferiblemente por un enlazador tal como un enlazador flexible glicina o glicina-serina de 6-10 aminoácidos de longitud, a fin de asegurar la funcionalidad de dichos componentes. El término "heterólogo", como se utiliza en esta memoria, puede significar, en primer lugar, que los componentes de la proteína de fusión no se presenten naturalmente enlazados de modo covalente uno a otro y, en segundo lugar, que los componentes procedan de especies diferentes. Proteínas de fusión se preparan usualmente utilizando tecnología de DNA recombinante (véase Sambrook et al., loc. cit.).

De acuerdo con la invención, el término "polipéptido que tiene la actividad biológica de una alcohol-deshidrogenasa dependiente de NAD o NADP" hace referencia a un grupo de enzimas que catalizan la conversión de alcoholes en aldehídos o cetonas o la reacción inversa correspondiente, es decir la conversión de aldehídos en alcoholes primarios o cetonas en alcoholes secundarios. La primera reacción mencionada corresponde en esta conexión a un proceso de oxidación, siendo el segundo tipo de reacción mencionado un proceso de reducción. El número EC de las alcohol-deshidrogenasas (ADHs) es EC1.1.1.1. El alcance de protección de la invención comprende, además de las enzimas existentes naturalmente aisladas en el curso de la presente invención, también aquellos polipéptidos que tienen los valores de identidad arriba mencionados al nivel de aminoácidos comparados con los polipéptidos aislados de fuentes naturales y que pueden originarse análogamente de fuentes naturales. Por otra parte, los mismos pueden modificarse por tecnología de DNA recombinante de tal modo que la actividad enzimática se retiene en su totalidad o esencialmente, como será previsto por el técnico experto (véase, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Handbook", 2ª edición 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor, Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY, 2001). Así pues, es posible que aminoácidos que no están localizados en el sitio activo y cuyo reemplazamiento con un aminoácido "de la misma clase" no es de esperar a primera vista que dé como resultado una estructura tridimensional sustancialmente alterada se reemplacen con un aminoácido "de la misma clase". Por ejemplo, aminoácidos particulares con cadenas laterales no polares (aminoácidos de la misma clase), puede esperarse que sean susceptibles de sustitución, por ejemplo valina en lugar de alanina, sin que esto tenga una influencia (sustancial) en la función biológica de la enzima, sobre la actividad enzimática de acuerdo con la invención. Basándose en su conocimiento especializado, el técnico experto puede deducir también conclusiones correspondientes en cuanto a la sustitución de otros tipos de aminoácidos (por ejemplo la sustitución de aminoácidos básicos con otros aminoácidos básicos o de aminoácidos con cadenas laterales polares sin carga con otros aminoácidos de este grupo).

El porcentaje de identidad de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos...

1. Un polipéptido que tiene la actividad biológica de una alcohol-deshidrogenasa dependiente de NAD o NADP, y que comprende las secuencias siguientes: una secuencia que es idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 34.

2. Una molécula de ácido nucleico, que codifica el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Una molécula de ácido nucleico, que es complementaria a la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2.

4. Un vector, que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3.

5. Un hospedador no humano, que comprende el vector de acuerdo con la reivindicación 4.

6. El hospedador de acuerdo con la reivindicación 5, que es una célula.

7. El hospedador de acuerdo con la reivindicación 5, que es un animal transgénico no humano.

8. El hospedador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que tiene una deshidrogenasa adicional adecuada para regeneración de cofactores o una molécula de ácido nucleico que codifica dicha deshidrogenasa.

9. El hospedador de acuerdo con la reivindicación 8, en el cual la deshidrogenasa adecuada para regeneración de cofactores es una formiato-deshidrogenasa o una glucosa-deshidrogenasa.

10. Un sistema de reacción, que comprende un compuesto orgánico que es un sustrato de una deshidrogenasa, el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, el vector de acuerdo con la reivindicación 4 o el hospedador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, y, en caso apropiado, un cofactor para el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.

11. El sistema de reacción de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual el compuesto orgánico que es un sustrato de una deshidrogenasa es un compuesto de carbonilo.

12. El sistema de reacción de acuerdo con la reivindicación 11, en el cual el compuesto de carbonilo es un aldehído o una cetona.

13. El sistema de reacción de acuerdo con la reivindicación 12, en el cual la cetona es una cetona sustituida asimétricamente.

14. El sistema de reacción de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual el compuesto orgánico que es un sustrato de una deshidrogenasa es un alcohol.

15. El sistema de reacción de acuerdo con la reivindicación 14, en el cual el alcohol es un alcohol primario o un alcohol secundario quiral.

16. El sistema de reacción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en el cual el cofactor es NADH, NADPH, NAD⁺ o NADP⁺.

17. Un proceso para preparar el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, proceso que comprende cultivar el hospedador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 y aislar dicho polipéptido.

18. Un proceso para preparar el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, proceso que comprende aislar dicho polipéptido de una muestra de fluido corporal o de tejido del hospedador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.

19. Un proceso para un compuesto orgánico que es un producto de una deshidrogenasa, proceso que comprende hacer reaccionar un compuesto orgánico que es un sustrato de una deshidrogenasa con el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, el hospedador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 o por medio del sistema de reacción de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16.

20. El proceso de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende adicionalmente el paso de aislar el producto de la reacción.

21. El proceso de acuerdo con la reivindicación 20, que comprende adicionalmente procesar el producto para dar un medicamento.

22. El proceso de acuerdo con la reivindicación 20, que comprende adicionalmente el paso de procesar el producto para dar un producto secundario.

23. El proceso de acuerdo con la reivindicación 22, que comprende adicionalmente el paso de formular el producto secundario en la preparación de un medicamento.

24. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, en el cual el producto es un alcohol enantioméricamente puro.