MUTANTES DE FACTORES DE CRECIMIENTO CON ACTIVIDAD BIOLOGICA AUMENTADA.

Proteína recombinante que comprende un dominio de nudo de cisteína con una identidad de aminoácidos de al menos 70% respecto al dominio de nudo de cisteína de 102 aa de GDF-5 humana como se muestra en los aminoácidos 400-501 de FIG.

1 o SEQ ID NO 1, en donde a) en dicha proteína recombinante, el aminoácido en la posición correspondiente a argi- nina 438 (R438) de GDF-5 humana de tipo salvaje como se muestra en SEQ ID NO 1 es alanina, valina, leucina, isoleucina o metionina, y/o b) en dicha proteína recombinante, el aminoácido de la posición correspondiente a aspa- ragina 445 (N445) de GDF5 humana de tipo salvaje como se muestra en SEQ ID NO 1 es serina o treonina

La presente invención se refiere a nuevos mutantes de factores de crecimiento biosintéticos recombinantes que exhiben actividad biológica aumentada. Dicha actividad proteínica au-mentada se consigue por la sustitución de aminoácidos específicos de las proteínas factores de crecimiento originales que existen naturalmente de la superfamilia β de factores de cre-10 cimiento transformantes de moléculas de señalización. Las proteínas recombinantes pro-porcionadas en esta invención son particularmente adecuadas para regeneración, estimulación y diferenciación del crecimiento de diversas células, tejidos y órganos. La in-vención se refiere también a moléculas de ácido nucleico que codifican dichos mutantes proteínicos recombinantes, vectores de expresión y células hospedadoras que contienen las 15 moléculas de ácido nucleico, anticuerpos dirigidos contra dichas proteínas mutantes, com-posiciones farmacéuticas y métodos para la producción de los mutantes de factores de cre-cimiento.

La superfamilia de proteínas del factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta) com-prende más de 35 miembros que incluyen TGF-betas, proteínas morfogenéticas óseas 20 (BMPs), activinas, inhibinas y factores de crecimiento/diferenciación (GDFs). Las proteínas de la superfamilia TGF-beta promueven la proliferación y diferenciación celular así como la formación de tejido y son relevantes para una extensa gama de métodos y aplicaciones de tratamiento médico. Estas moléculas dímeras actúan a través de complejos receptores es-pecíficos que están compuestos por quinasas receptoras serina/treonina de tipo I y tipo II. 25 Las quinasas receptoras activan subsiguientemente proteínas Smad, que propagan luego las señales hasta el núcleo a fin de regular la expresión de los genes diana. Caminos de señalización independientes de Smad son iniciados también por estos receptores y dan como resultado la inducción del camino de las quinasas MAP. Las Smads son una familia singular de moléculas de transducción de señales que pueden transmitir señales directa-30 mente desde los receptores de la superficie celular al núcleo, donde las mismas regulan la transcripción por interacción con parejas de fijación de DNA y coactivadores y correpresores de la transcripción.

Los miembros de esta familia de proteínas se sintetizan inicialmente como proteínas precur-soras heterogéneas grandes que sufren subsiguientemente escisión proteolítica en un con-35 junto de residuos básicos de aproximadamente 110-140 aminoácidos del término C, liberando así las partes de proteína madura C-terminales del prodominio N-terminal. Todos los polipéptidos maduros están relacionados estructuralmente y contienen un dominio bioac-

tivo conservado que comprende seis o siete residuos cisteína canónicos que son responsa-bles del motivo tridimensional característico "nudo de cisteína" de estas proteínas.

Los diversos miembros de la superfamilia pueden clasificarse ulteriormente en subfamilias y subgrupos distintos, basados en la extensión de homología/identidad de su motivo núcleo de cisteína. Se sabe que las unidades solapantes de proteínas morfogenéticas óseas y fac-5 tores de crecimiento/diferenciación (GDFs) juegan una serie diversa de papeles en el siste-ma esquelético y otros tejidos (véase, a saber, Ducy y Karsenty 2000, Kidney Int. 57, 2207-2214 para una revisión). Especialmente la GDF-5 humana (la proteína se conoce también como MP52, CDMP-1 o a veces como BMP-14), GDF-6 (CDMP-2, BMP13) y GDF-7 (CDMP-3, BMP-12) han sido agrupadas como un grupo por varios autores debido a sus 10 propiedades biológicas comparables y al grado extraordinariamente alto de identidad de secuencia de aminoácidos (véase p.ej. Mikic 2004, Annals of Biomedical Engineering 32, 466-476; Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330).

Además de las funciones prominentes del subgrupo GDF-5/-6/-7 en la formación de novo de hueso y cartílago (Cheng et al. 2003, J. Bone & Joint Surg. Am. 85-A, 1544-1552; Set-15 tle et al. 2003, Developm. Biol. 254, 116-130), se ha demostrado repetidas veces que los miembros de este subgrupo son también inductores y reguladores importantes de tendón y ligamento (Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330), tejido nervioso (Farkas et al. 1997, Neurosci Lett. 236,120-122; Watakabe et al. 2001, J. Neurochem. 76, 1455-1464), ligamento periodontal y dientes (Sena et al 2003, J. Dent. Res. 82, 166-20 171; Morotome et al. 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 244, 8590), y otros tejidos.

Las estructuras de genes y proteínas de diversos(as) BMPs/GDFs existentes naturalmente, con inclusión de GDF-5, GDF-6 y GDF-7 han sido esclarecidas previamente. Pudieron iden-tificarse varios mutantes de pérdida de función de GDF-5 que, conducen v.g. al acortamien-to de los dedos de las manos y los pies (braquidactilia tipo C) y otras anormalidades 25 esqueléticas tales como braquipodismo en animales (Storme et al. 1994, Nature 368, 639-643) y displasias acromesomélicas en el hombre (Thomas et al. 1996, Nature Gen. 12, 315-317). Con respecto a estos mutantes se ha encontrado que sustituciones específicas de aminoácidos en las posiciones 173, 204, 400, 438, 441 y 498 de GDF-5 humana reducen o anulan por completo la función de la proteína (Schwabe et al. 2004, Amer. J. Med. Genet. 30 124A, 356-363). En contraste, únicamente muy pocos mutantes de GDF con actividad bio-lógica incrementada se conocen hasta la fecha. Un ejemplo raro se describe en WO 01/11041 y se refiere a GDF-5 monómera activa que carece del residuo cisteína normal-mente responsable de la dimerización.

WO 95/04810 describe una proteína de la familia TGF-β así como el DNA que codifica esta 35 proteína y una composición farmacéutica que contiene esta proteína.

La búsqueda de las moléculas responsables de la actividad inductora de hueso, cartílago, y otros tejidos ha conducido al descubrimiento de una serie de moléculas denominadas facto-

res de crecimiento/diferenciación. Debido a sus actividades singulares inductoras de tejido, estas proteínas han sido aplicadas con éxito en investigación terapéutica y cirugía regenera-tiva en la cual las mismas promueven y coadyuvan al proceso de curación natural de tejidos deteriorados, sea solas o en combinación con materiales específicos portadores y/o de ma-triz. Sin embargo, existe una gran necesidad de desarrollar formas mejoradas y más eficien-5 tes de estas proteínas para tales propósitos.

Este objeto se resuelve de acuerdo con la invención por proporcionar nuevas proteínas re-combinantes derivadas de proteínas afines a GDF-5 que exhiben actividad biológica mejo-rada como se describe en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas.

Algunos términos utilizados frecuentemente en esta memoria se definen e ilustran como 10 sigue:

El término "dominio de nudo de cisteína", como se utiliza en esta memoria, significa la re-gión bien conocida y conservada de aminoácidos rica en cisteína que está presente en las partes maduras de las proteínas de las superfamilia TGF-beta tales como GDF-5 humana y que forma una estructura de proteína tridimensional conocida como nudo de cisteína. En 15 este dominio, es importante la localización respectiva de los residuos cisteína unos respecto a otros, y sólo está permitido que varíe ligeramente a fin de no perder la actividad biológica. Secuencias de consenso para dominios de nudo de cisteína se conocen en la técnica ac-tual. De acuerdo con la definición dada en esta memoria, el dominio de nudo de cisteína de una proteína comienza con el primer residuo cisteína que participa en el nudo de cisteína de 20 la proteína respectiva y termina con el residuo que sigue a la última cisteína que participa en el nudo de cisteína de la proteína respectiva. Por ejemplo, el dominio de nudo de cisteína de la proteína precursora de GDF-5 humana (SEQ ID NO. 1) comprende los aminoácidos 400-501 (véase también Fig. 1).

La expresión "proteína afín a GDF-5" como se utiliza en esta memoria, significa cualquier 25 proteína existente naturalmente o creada artificialmente que comprende un dominio de nudo de cisteína con una identidad de aminoácidos de al menos 70% respecto al dominio de nu-do de cisteína de 102 aa de GDF-5 humana (aminoácidos 400-501 de Fig. 1/SEQ ID NO. 1) y que lleva residuos arginina, serina y asparagina en posiciones equivalentes a los residuos arginina 438 (R438), serina 439 (S439) y asparagina 445 (N445) de GDF-5 humana. Se 30 incluyen proteínas pertenecientes al grupo de proteínas GDF-5,...

1. Proteína recombinante que comprende un dominio de nudo de cisteína con una identidad de aminoácidos de al menos 70% respecto al dominio de nudo de cisteína de 102 aa de GDF-5 humana como se muestra en los aminoácidos 400-501 de FIG. 1 o SEQ ID NO 1, en donde

a) en dicha proteína recombinante, el aminoácido en la posición correspondiente a argi-nina 438 (R438) de GDF-5 humana de tipo salvaje como se muestra en SEQ ID NO 1 es alanina, valina, leucina, isoleucina o metionina, y/o

b) en dicha proteína recombinante, el aminoácido de la posición correspondiente a aspa-ragina 445 (N445) de GDF5 humana de tipo salvaje como se muestra en SEQ ID NO 1 es serina o treonina.

2. Proteína de acuerdo con la reivindicación 1,

en donde la misma comprende una secuencia que coincide con una de las fórmulas genéri-cas de aminoácidos siguientes:

o

o

o

o

o

o

en donde X1 a X33 denotan cualquier aminoácido, Z1 denota alanina, valina, leucina, isoleu-cina, o metionina, Z2 denota ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, leucina o isoleucina, y Z3 denota serina o treonina.

3. Proteína de acuerdo con la reivindicación 2,

en donde

X1 denota asparagina (N) o serina (S)

X2 denota arginina (R) o lisina (K)

X3 denota alanina (A), glutamina (Q), prolina (P) o serina (S)

X4 denota asparagina (N) o ácido aspártico (D)

X5 denota arginina (R) o lisina (K)

X6 denota ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E)

X7 denota leucina (L) o metionina (M)

X8 denota isoleucina (I) o valina (V)

X9 denota ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E)

X10 denota histidina (H), fenilalanina (F) o tirosina (Y)

X11 denota ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E)

X12 denota leucina (L), metionina (M) o valina (V)

X13 denota ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E)

X14 denota isoleucina (I) o leucina (L)

X15 denota isoleucina (I) o valina (V)

X16 denota leucina (L) o metionina (M)

X17 denota alanina (A), asparagina (N) o ácido aspártico (D)

X18 denota arginina (R), asparagina (N), ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), glicina (G) o serina (S)

X19 denota alanina (A), asparagina (N), serina (S) o treonina (T)

X20 denota alanina (A), metionina (M) o treonina (T)

X21 denota alanina (A) o prolina (P)

X22 denota serina (S) o treonina (T)

X23 denota alanina (A), serina (S) o treonina (T)

X24 denota arginina (R) o lisina (K)

X25 denota serina (S) o treonina (T)

X26 denota fenilalanina (F) o tirosina (Y)

X27 denota isoleucina (I) o treonina (1)

X28 denota alanina (A) o serina (S)

X29 denota alanina (A) o glicina (G)

X30 denota asparagina (N) o lisina (K)

X31 denota ácido glutámico (E) o glutamina (Q)

X32 denota ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E),

X33 denota alanina (A), glutamina (Q), serina (S) o treonina (T)

Z1 denota alanina (A), isoleucina (I), leucina (L), metionina (M) o valina (V)

Z2 denota ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), glicina (G), leucina (L) o isoleucina (I)

Z3 denota serina (S) o treonina (T)

4. Acido nucleico, que codifica

una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 anteriores.

5. Vector de expresión, que comprende

un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Célula hospedadora, que contiene

un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Composición farmacéutica, que comprende

una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o/y un ácido nu-cleico de acuerdo con la reivindicación 4, o/y un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5, o/y una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende adicio-nalmente sustancias adyuvantes y/o portadoras farmacológicamente aceptables.

9. Composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 7 y 8,

en donde la proteína y/o el ácido nucleico y/o el vector y/o la célula hospedadora están con-tenidas en o sobre un material matriz biocompatible.

10. Una composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 7 a 9,

para la prevención o terapia de enfermedades para las cuales estarían indicadas proteínas afines a GDF-5.

11. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10,

para la prevención o terapia de lesiones o enfermedades en conexión con hueso deteriora-do, cartílago, tejido conectivo, unión de tejido conectivo, tendón, ligamento, disco espi-nal/intervertebral, menisco, tejido dental, dentina, ligamento periodontal, vasos sanguíneos, piel, cabello o tejido neural.

12. Un método para la producción de una proteína recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende preparar de manera recombinante una proteína derivada de una proteína afín a GDF-5 por

a) reemplazamiento del aminoácido de la posición correspondiente a arginina 438 (R438) de GDF-5 humana de tipo salvaje (SEQ ID NO 1) con alanina, valina, leucina, isoleucina o me-tionina; y/o

b) reemplazamiento del aminoácido de la posición correspondiente a asparagina 445 (N445) de GDF-5 humana de tipo salvaje (SEQ ID NO 1) con serina o treonina.

13. Un anticuerpo específico para una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

14. Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica y/o diagnóstica para diagnosis, prevención y/o terapia de enfermedades asociadas con deterioro de hueso y/o cartílago o que afectan a enfermedades de hueso y/o cartílago.

15. Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica para promover la formación de cartílago y/o hueso y/o fusión espinal.

16. Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica y/o diagnóstica para la diagnosis, prevención y/o terapia de tejido lesionado o enfermo asociado con tejido conectivo que incluye tendón y/o ligamento, tejido periodontal o dental con inclusión de mutantes dentales, tejido neural con inclusión del tejido del CNS y situaciones neuropatológicas, tejido del sistema sensorial, hígado, páncreas, cardiaco, vasos sanguíneos, tejido renal, uterino y tiroideo, piel, membra-nas mucosas, endotelio y epitelio.

17. Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica y/o diagnóstica para la inducción del crecimiento

de los nervios, regeneración tisular, angiogénesis, curación de las heridas con inclusión de úlceras, quemaduras, lesiones y/o injertos de piel.

18. Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica y/o diagnóstica para la inducción de la prolifera-ción de células progenitoras y/o células de la médula ósea.

19. Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica y/o diagnóstica para mantenimiento de un estado de proliferación o diferenciación para tratamiento o preservación de tejidos o células para trasplante de órganos o tejidos.

20. Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica y/o diagnóstica para la integridad del revestimien-to gastrointestinal.

21. Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica para el tratamiento de las perturbaciones en la fertilidad.

22. Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica para aplicaciones que conciernen a las articula-ciones de los elementos esqueléticos y/o para reparación de menisco y/o disco espinal/intervertebral.

23. Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica para la prevención y/o el tratamiento de trastornos neudegenerativos tales como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y enfer-medad de Huntington.

24. Uso de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, un vector de expresión de acuerdo con la

reivindicación 5 y/o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 6, para la fa-bricación de una composición terapéutica para promoción del crecimiento del cabello.