Métodos y dispositivo biosensor para medida microinterferométrica del potencial de membrana neuronal.

La invención describe un método para la monitorización del potencial de membrana neuronal mediante el análisis de los patrones espacio-temporales de difracción de un haz de luz coherente incidente sobre la célula. La invención incluye un dispositivo compatible con sistemas de microscopia convencionales para la cuantificación de la distribución angular del patrón de difracción así como un sistema de medida diferencial con filtro adaptativo compensador de canal para la cancelación del ruido de la fuente de luz y la mejora de la relación señal-ruido. A diferencia de las técnicas convencionales, los métodos y dispositivo descritos en la invención no requieren del uso de cromóforos o fluoróforos, solventando los problemas de "bleaching", toxicidad y variabilidad en la calidad del marcaje y en la relación señal-ruido característicos de los marcadores sensibles a voltage (voltage-sensitive dyes, VSDs)

Métodos y dispositivo biosensor para medida microinterferométrica del potencial de membrana neuronal.

Campo de la invención

La invención tiene aplicación en el campo de la biomedicina.

Objeto de la invención

La invención incluye métodos y dispositivo para la monitorización óptica del potencial de membrana celular. La invención se fundamenta en los cambios producidos por variaciones en el potencial de membrana sobre los patrones espacio-temporales de difracción de luz coherente incidente sobre la célula estudiada. Los métodos y dispositivos descritos en la invención suponen una mejora técnica sustancial respecto a las técnicas ópticas tradicionales basadas en marcadores moleculares sensibles a potencial (voltage-sensitive dyes, VSDs), al eliminar la fototoxicidad y el fotobleaching que afectan a éstos.

Antecedentes

La monitorización de la actividad eléctrica producida por neuronas in vitro es necesaria para el estudio del funcionamiento del tejido nervioso, por ejemplo, con el objeto de identificar fármacos efectivos en el tratamiento y/o prevención de neuropatologías. Dicha actividad eléctrica está caracterizada por cambios transitorios en el potencial eléctrico de la membrana celular (potenciales de acción, Kandel et al. 2000), típicamente de una magnitud máxima de aproximadamente 100 mV y duración del orden de 1 milisegundo. Éstos han sido tradicionalmente detectados mediante técnicas electrofisiológicas (ver Molecular Devices, The Axon Guide, 2006) que requieren el uso de microelectrodos situados en contacto con la célula.

La necesidad de emplear microposicionadores hidráulicos, piezoeléctricos o mecánicos con resoluciones submicrométricas para la manipulación del microelectrodo dificulta la medida simultánea de múltiples células. Aunque varios micromanipuladores pueden emplearse en paralelo para la detección de potenciales intracelulares en hasta tres neuronas (Bi G.Q. et al. Distributed synaptic modification in neural networks induced by patterned stimulation Nature 401(6755):792-6 1999) la consecución de medidas intracelulares simultáneas en números superiores de células es progresivamente más complicada.

A esta limitación de las técnicas electrofisiologías convencionales, se suma la pobre estabilidad del interface microelectrodo-neurona. En efecto, el contacto físico entre el microelectrodo y la membrana celulares, necesario para medidas intracelulares, raramente hace posible experimentos de duración superior a una hora. Sin embargo, medidas de mayor duración son con frecuencia necesarias, por ejemplo para la evaluación a largo plazo (semanas o meses) de nuevos fármacos o para el estudio de los mecanismos que guían el desarrollo morfológico y funcional de células in vitro.

En respuesta a las limitaciones técnicas de los métodos electrofisiológicos covencionales, se han propuesto estrategias ópticas basadas en la monitorización de los transitorios del potencial de membrana mediante la observación de los cambios provocados por éstos en la absorción y/o fluorescencia ópticas de marcadores moleculares sensibles a potencial (voltage-sensitive dyes, VSDs). Los VSDs son cromóforos o fluoróforos utilizados a modo de tinción de membrana, cuyas propiedades ópticas son moduladas por el potencial eléctrico de ésta (Tasaki et al. Changes in extrinsic fluorescence of nerve produced by electric stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. 64(4):1362-8 1969; Cohen L. Optical monitoring of physiological-activity - a brief-history. Japanese Journal of Physiology 43: s1-s6 suppl. 1 1993; patente US 6,979,553 Use of Nernstein voltage sensitive dyes in measuring transmembrane voltage, de Farinas et al. 2005; patente US 7,087,416 Detection of transmembrane potentials by optical methods, de Tsien et al. 2006).

La compatibilidad de los VSDs con detectores multipixel (por ejemplo cámaras CCDs) facilita la monitorización simultánea de múltiples células. Por otro lado, si bien la ausencia de contacto físico entre un microelectrodo y la membrana celular elimina el riesgo de daño mecánico de ésta, los VSDs sufren de limitaciones que reducen su utilidad en el campo de las neurociencias. En primer lugar, el "bleaching", es decir la degradación de las propiedades del marcador por efecto de la iluminación durante el proceso de medida, reduce el tiempo de experimentación (con observación continua) a menos de una hora. El orden de magnitud de la duración de un experimento con VSDs es pues comparable al que caracteriza las técnicas electrofisiológicas convencionales (Jin W. et al. Voltage-sensitive dye imaging of population neuronal activity in cortical tissue. J Neurosci Methods. Mar 30;115(1):13-27 2002). La dependencia de la toxicidad de los VSDs con el subtipo neuronal y la variabilidad en la calidad del marcaje, con la resultante impredecibilidad de la relación señal-ruido, son otras características negativas de los marcadores sensibles a voltaje.

Con anterioridad al desarrollo de los VSDs, se había observado que, incluso en ausencia de marcadores, diversas propiedades ópticas del axón (opacidad, birefringencia e intensidad del scattering) varían transitoriamente durante la generación de un potencial de acción: Hill et al. (Hill D.K. et al. Opacity changes in stimulated nerve, J. Physiol 108:278-281 1949; Hill D.K. The effect of stimulation on the opacity of a crustacean nerve trunk and its relation to fibre diameter. J. Physiol. 111(3-4):283-303 1950), Bryant S.H. et al. (Bryant S.H. et al. Changes in light scattering accompanying activity in nerve. J. Cellular Comp. Physiol. 40(2):199-219 1952), Cohen et al. (Cohen L.B. et al. Evidence for structural changes during the action potential in nerves from the walking legs of Maia squinado. J. Physiol. 194(2):85 1968; Cohen L.B. et al. Light scattering and birefringence changes during nerve activity. Nature 218:438-441 1968; Cohen L.B. et al. Changes in axon birefringence J. Physiol. 211:495-515 1970; Cohen L.B., Landowne D. Light-scattering changes in voltage-clamped squid giant axons. Journal of General Physiology 55 (1):144 1970; Cohen et al., Changes in light scattering associated with the action potential in crab nerves. J. Physiol. 212:259-275 1971; Cohen L.B. et al. Analysis of the potential-dependent changes in optical retardation in the squid giant axon. J. Physiol. 218(1):205-237 1971; Cohen L.B. et al Changes in light scattering that accompany the action potential in squid giant axons: potential-dependent components. J Physiol. 224:701-725 1972; Cohen L.B. et al. Changes in light-scattering that accompany action potential in squid giant axons - potential-dependent components. Journal of Physiology-London 224 (3):701 1972; Cohen L.B. et al. Changes in axon light-scattering that accompany action potential - current- dependent components. Journal of Physiology-London 224 (3):727 1972; Cohen L. Optical monitoring of physiological-activity - a brief-history. Japanese Journal of Physiology 43: s1-s6 suppl. 1 1993), Stepnoski et al. (Stepnoski et al. Noninvasive detection of changes in membrane-potential in cultured neurons by light-scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88 (21): 9382-9386 1991) y Tasaki et al. (Tasaki I. et al. Optical-changes during nerve excitation - interpretation on the basis of rapid structural-changes in the superficial gel layer of nerve-fibers. Physiological Chemistry and Physics and Medical NMR 26 (1): 101-110 1994; Tasaki I. et al. Swelling of squid giant-axon during action-potentials. Biological Bulletin 159 (2): 494-494 1980).

La señal óptica s asociada con el potencial de acción, expresada como la variación relativa de la intensidad de luz en el pico del potencial de acción,

s = frac{? I}{I}

toma valores del orden de 1-10×10^-6 (con axones de invertebrados) comparados con 1-5×10^-2 (1-5%) típicamente obtenidos con VSDs. Debido a la baja sensibilidad de los métodos intrinsecos, éstos han requerido tradicionalmente de promediado para obtener suficiente relación señal-ruido. Los VSDs, en cambio, permiten medidas de potenciales de acción individuales, sin necesidad de promediado. En consecuencia, la investigación en el área se ha centrado en la resolución de los problemas inherentes a VSDs (bleaching, fototoxicidad y impredictibilidad de la tinción). Los métodos intrínsecos, en el contexto de las medidas en neurons individuales, han...

1. Método para la medida del potencial eléctrico de la membrana celular sin necesidad de marcadores extrínsecos, cromóforos y fluoróforos, que comprende: a) la iluminación de la célula y b) el análisis del patrón de difracción producido por ésta en un plano de observación distante.

2. Método según reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de iluminación es coherente y genera un patrón de interferencia.

3. Método según reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el patrón de difracción se obtiene mediante un haz enfocado sobre la membrana celular por medio de una lente convergente.

4. Método de utilización del dispositivos según reivindicación 1, incluyendo: a) cultivo de neuronas libres de glía para minimización de la perturbación del haz por células no neuronales; b) filtrado del medio de cultivo previo a la medida de difracción; c) posicionamiento del haz sobre la célula; d) medida del patrón de difracción; e) cancelación del ruido de la fuente e f) identificación de los potenciales de acción en la señal óptica.

5. Dispositivo para la implementación del método según reivindicación 1, incluyendo: a) una fuente de luz (1) incidente sobre una célula libre de cromóforos o fluoróforos; b) uno o más medios de fotodetección (9) con el objeto de monitorizar el patrón de difracción producido por ésta; y d) microposicionador para el desplazamiento relativo del haz y de la célula (8).

6. Dispositivo según reivindicación 5, incluyendo elementos ópticos para el colimado y enfoque del haz (2-5).

7. Dispositivo según reivindicación 5, incluyendo un sistema de cancelación del ruido de la fuente de luz caracterizado por a) reflector parcial del haz (6), b) al menos un elemento fotodetector (7) sirviendo como referencia; c) conversor analógico-digital; d) filtro adaptativo digital (14) para estimación del ruido de la fuente a partir de la señal de referencia y e) sustractor del ruido de la señal medida.