Método para separación y detección de protozoarios.

Un método que permite la separación y detección de protozoarios,

con potencial para extenderse a especies de fisiología similar, a través de la ingestión por los mismos de material magnético biocompatible. El método tiene las siguientes etapas: realizar un cultivo de la especie con ferrofluido biocompatible consistente en nanopartículas de magnetita de tamaños en el rango aproximado de 20 < d < 150 nm recubiertas con dextrano, en concentraciones de 10 a 80 mg/ml, separar la población de parásitos que han incorporado efectivamente las partículas magnéticas, a través de centrifugación en gradiente discontinuo de densidades; y detectar la población de parásitos magnetizados a través de un magnetómetro o susceptómetro, que permite medir la imantación del cultivo; y comparar la imanación del cultivo con la del ferrofluido puro como referencia

Método para separación y detección de protozoarios.

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención es un método que permite la separación y detección de protozoarios a través de la ingestión por los mismos de material magnético biocompatible, con potencial para extenderse a otros organismos unicelulares eucariotas (reino Protista) de fisiología relacionada tales como algas, bacterias, y hongos.

Estado de la técnica

La propagación de diversas enfermedades infecciosas a través de especies de protozoarios en animales y humanos es uno de los principales problemas de la salud pública en diversos países en desarrollo. En un considerable número de estas enfermedades (por ej. Tripanosomiasis Africana o Americana, o Leishmaniasis), no se dispone hasta hoy de vacunas para prevenirlas ni medicamentos eficientes para su tratamiento. Las alternativas terapéuticas actualmente disponibles presentan problemas tales como poca eficiencia terapéutica, efectos colaterales severos y el surgimiento de cepas resistentes [ver referencia SIL05].

La tripanosomiasis que presenta la mayor diversidad de complicaciones clínicas es la americana, siendo caracterizada por una fase inicial (aguda), con una parasitemia evidente, seguida de una fase indeterminada, asintomática, que evoluciona a una fase crónica, con sintomatologías características. Dependiendo de cada fase, los exámenes recomendados para la detección en laboratorio incluyen: observación directa de sangre (frotis y gota gruesa), técnicas de concentración de sangre (Strout, microstrout), hemocultivo e incluso métodos indirectos serológicos (hemaglutinación directa o indirecta, inmunofluorescencia indirecta y ELISA) [ver referencia WHO06]. Estos métodos son complejos y costosos. Por otro lado, métodos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas Polymerase Chain Reaction en inglés) todavía no forma parte de la rutina laboratorial diagnóstica, por lo tanto hasta ahora ésta técnica sólo está disponible en laboratorios de investigación.

Frente a estas dificultades para establecer exámenes fiables en clínicas y laboratorios, la posibilidad de detección de parásitos a través de técnicas magnéticas conlleva la evidente ventaja de ser un método no invasivo, rápido y de bajo costo.

Los usos previamente reportados de nanopartículas magnéticas en bacterias o unidades biológicas menores están relacionados a la aplicación de gradientes de campo magnético para separación y fijación [GU05,BUC03]. Sin embargo, la presente propuesta esta basada en la inclusión (fagocitosis) de las nanopartículas magnéticas por los protozoarios, y posterior análisis y detección por técnicas magnetométricas estándar.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a un método para la detección y cuantificación de la concentración de parásitos presentes en una muestra de sangre. La técnica propuesta utiliza como elemento básico una suspensión coloidal biocompatible de magnetita o hierro en base acuosa, de concentración variable. El material magnético consiste en una distribución de nanopartículas magnéticas, compuestas de núcleos magnéticos de magnetita (Fe₃O₄) de <d> = 20 nm y coberturas de polisacáridos (por ej. Dextrano) o péptidos.

Este método permite la separación y detección de protozoarios (ya verificada en dos especies, y con potencial para extenderse a especies de fisiología similar) a través de la ingestión de material magnético biocompatible. La detección de parásitos en concentraciones de 10⁴-10⁵ individuos/ml similares a las concentraciones en sangre.

El método de la invención es potencialmente adaptable a la detección in vivo, dependiendo de la respuesta (fisiología) de cada protozoario en los diferentes estadios de su ciclo de vida.

El proceso de separación propuesto garantiza que la señal magnética está vinculada a los parásitos asociados a parte del material magnético.

La técnica de detección de los parásitos magnetizados posee, respecto a las actuales técnicas de laboratorio, las ventajas de ser rápido (2-10 seg en la detección), de bajo coste (infraestructura usual de un Lab. de análisis) y sencilla implementación (utilización de técnicas de separación por centrifugación en un gradiente discontinuo de densidades comúnmente empleadas).

El proceso consiste en tres etapas principales:

1. Cultivo de la especie con ferrofluido biocompatible consistente en nanopartículas de magnetita de tamaños en el rango aproximado de 20 < d < 150 nm recubiertas con polisacáridos/péptidos, en concentraciones de 10 hasta 80 mg/ml.

2. Separación de la población de parásitos que han incorporado efectivamente las partículas magnéticas, a través de centrifugación en gradiente discontinuo de densidades.

3. Detección de la población de parásitos magnetizados se realiza a través de un magnetómetro o susceptómetro, que permite medir la imantación del cultivo y compararlo con el ferrofluido puro como referencia.

Las etapas del proceso se describirán ahora en detalle en una descripción de experimentos específicos realizados.

Descripción de los experimentos específicos realizados

En diversos experimentos realizados, las etapas del método se llevaron a la práctica de la forma siguiente:

1. Cultivos

Los epimastigotes de T. cruzi cepa CL clon 14 son crecidos en medio LIT suplementado con 10% de SFB, mantenidos en fase exponencial por repique cada 24/48 horas. Se hizo un segundo experimento idéntico al primero, con T cruzi, con diferente proceso de resuspensión, llevando a los mismos resultados.

Dos ferrofluidos (coloides) : #1 (350 nm) y #4 (20 nm). Incubación durante la noche (aprox. 16 hs de incubación 10⁹ células en 4 ml de medio de cultivo).

2. Separación

Usando sacarosa para formar un gradiente discontinuo de densidad, se separa la mezcla de parásitos asociados a partículas de las partículas que sobran (partículas libres). En detalle:

1. Resuspender la muestra agitando.

2. En un tubo Falcon de 15 ml pipetear 2 ml de sacarosa 2 M en PBS (colchón de sacarosa). Sobre este colchón, pipetear el cultivo. Centrifugación (3000 x g) 10 minutos en colchón de Sacarosa 2 M.

Un experimento idéntico, utilizando el protozoário Crithidia deanei mostró comportamiento similar, excepto que no hubo formación de pellet. Se cultivaron en medio de Warren suplementado con 10% SFB.

3. Detección magnética

Los parásitos fueron detectados a través de la observación de la temperatura de bloqueo en las curvas M(T) en modo zero-field-cooling. También fue observada la señal magnética en los ciclos de imanación M(H) a temperatura ambiente.

Para todas las muestras, medimos

a. M(T) a 100 G en modo ZFC para ver el bloqueo de las partículas, y

b. los ciclos M(H) a 10 K y 240 K.

Los protozoos que han fagocitado las partículas magnéticas poseen imanación suficiente para ser atraídos por un imán, con lo que puede implementarse una etapa previa de concentración vía separación magnética, tanto en el tubo de ensayo cuanto en un portaobjetos de microscopio. Se ve a simple vista la aglomeración en la pared del tubo.

Los limites de detección varían según el instrumento utilizado, pero su limite inferior puede estimarse a partir de la sensibilidad de magnetómetros SQUID de uso corriente [ver referencia SQU97]. Estos magnetómetros pueden detectar señales del orden de 10^-6 emu, [ver referencia SQU00] lo que correspondería a 10⁶-10⁸ partículas de Fe₃O₄ con diámetros d = 150 y 20 nm, respectivamente. Para transformar estos valores de 10⁶ - 10⁸ partículas/ml en concentración de protozoarios, debe corregirse por un factor que depende del numero medio de partículas fagocitadas (10 partículas de 150 nm, o 50 partículas de 20 nm por protozoario), lo que implica un limite de detección menor que 10⁵ protozoarios/ml, muy por debajo de las concentraciones usuales en sangre de portadores infectados en el estadio inicial.

Una vez descritas suficientemente las características de la invención, sólo debe añadirse que pueden realizarse modificaciones de detalle siempre que no afecten a las características esenciales de la misma,...

1. Un método para la separación y detección de protozoarios u otros organismos unicelulares eucariotas (reino Protista) de fisiología relacionada caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

2. Uso del método para la separación y detección de protozoarios de la reivindicación 1 para la diagnosis de enfermedades infecciosas que se propagan en animales y humanos a través de especies de protozoarios u otros organismos unicelulares eucariotas (reino Protista) de fisiología relacionada tales como algas, bacterias, y hongos.