Método de producción de ácido succínico a partir de hidrolizados de calidad industrial que comprende :

a) suministrar un organismo de una cepa de Escherichia coli seleccionada de AFP 184 (ATCC PTA 5132), AFP 400 (ATCC PTA 5583) y AFP 404 (ATCC PTA 5133); b) permitir que dicho organismo acumule biomasa; y c) permitir que dicho organismo metabolize el hidrolizado

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 5

1. Campo de la invención

Esta invención se refiere a un método de fermentación para producir ácido succínico, y a determinados mutantes bacterianos que pueden utilizar una miríada de azúcares para producir ácido succínico como producto de fermentación principal.

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2. Antecedentes de la invención

Los ácidos carboxílicos son prometedores como posibles precursores de numerosos productos químicos. Por ejemplo, el ácido succínico puede servir como materia prima para precursores de plásticos tales como 1,4-butanodiol (BDO), tetrahidrofurano y gamma-butirolactona. Están en desarrollo nuevos productos 15 derivados del ácido succínico, siendo el más notable de estos el poliéster que se fabrica uniendo ácido succínico y BDO. Generalmente, los ésteres del ácido succínico tienen el potencial de ser disolventes nuevos, “verdes” que pueden sustituir a disolventes más nocivos. En total, el ácido succínico puede servir como precursor para millones de libras de productos químicos anualmente a un valor de mercado total de 20 más de mil millones de dólares. Junto con el ácido succínico, también otros ácidos 4-caton-dicarboxílicos, tales como ácido málico y ácido fumárico, son posibles materias primas.

La producción de estos ácidos carboxílicos a partir de materias primas renovables (en este caso a través de procesos de fermentación) es un camino para 25 sustituir los métodos intensivos que consumen más energía de derivación de tales ácidos a partir de fuentes no renovables. El succinato es un producto intermedio de fermentaciones anaerobias por bacterias que producen propionato, pero esos procesos dan como resultado bajos rendimientos y concentraciones.

Las bacterias anaeróbicas del rumen, tales como Bacteroides ruminicola y 30 Bacteroides amylophilus también producen succinato. Sin embargo, los organismos del rumen son característicamente inestables en procesos de fermentación.

Desde hace mucho tiempo se sabe que se produce una mezcla de ácidos a partir de la fermentación de E. coli, tal como se detalla en Stokes, J.L. 1949

“Fermentation of glucose by suspensions of Escherichia coli” J. Bacteriol. 57:147-158. Sin embargo, por cada mol de glucosa fermentada, se producen sólo 1,2 moles de ácido fórmico, 0,1-0,2 moles de ácido láctico y 0,3-0,4 moles de ácido succínico. Como tal, los esfuerzos para producir ácidos carboxílicos de manera fermentativa han dado como resultado cantidades relativamente grandes de sustratos de crecimiento, tales 5 como glucosa, que no se convierten en el producto deseado.

Algunas bacterias, tales como A. succiniciproducens, utilizadas en procesos de fermentación tal como se explica resumidamente en la patente estadounidense n.º. 5.143.834 de Glassner et al., producen de manera natural ácido succínico en litros moderados sólo hasta aproximadamente 35-40 gramos por litro (g/l). Se ha mostrado 10 que la cepa huésped A. succiniciproducens no es altamente osmotolerante porque no tolera concentraciones altas de sales y además se inhibe mediante concentraciones moderadas de producto. Por último, A. succiniciproducens presenta problemas de manejo porque como anaerobio obligado, los procedimientos que usan el organismo deben realizarse en ausencia de oxígeno. Además, la preparación del medio para el 15 inóculo requiere la adición de triptofano.

Los esfuerzos anteriores de los inventores para producir ácido succínico han dado como resultado el aislamiento y la utilización de una bacteria mutante. El mutante, disponible como número de registro de la ATCC 202021, es el sujeto de la solicitud de patente estadounidense reexpedida n.º 09/429.693 (US RE37.3936; 25 de 20 septiembre de 2001). La solicitud reexpedida n.º 09/429.693, enseña una cepa bacteriana que produce ácido succínico (AFP 111) que muta espontáneamente a partir de su precursor. El mutante puede crecer de manera fermentativa sobre glucosa para producir ácido succínico en altos rendimientos, mientras que sus precursores no lo pueden hacer. Sin embargo, un inconveniente obvio de utilizar este método de 25 producción de ácido succínico es su limitación a un único mutante.

Otros esfuerzos (patente estadounidense n.º 6.159.738) de los inventores han dado como resultado un método para elaborar cepas bacterianas que tienen una producción aumentada de ácido succínico. El método enseña que la alteración del gen de la fosfotransferasa de E. coli provoca que las bacterias produzcan más ácido 30 succínico. Un inconveniente de este método es su limitación a una única alteración.

Existe una necesidad en la técnica de un método para producir ácido succínico de manera fermentativa, por lo cual el método no esté relegado a un único mutante o gen. El método debe permitirse mediante cualquier organismo que tenga un genotipo

fácilmente determinado y particular. El método debe poder realizarse en condiciones relativamente inertes usando organismos robustos (es decir, aquellos que tienen altos umbrales de inhibición por retroalimentación), y también de modo que se obvie la necesidad de medidas de control medioambiental sofisticadas. El método debe producir resultados superiores utilizando mezclas de azúcares derivados de la 5 hidrólisis de materiales lignocelulósicos, puesto que estos sustratos ofrecen una fuente más barata de azúcares, y como tal, su uso puede reducir los costes de producción del ácido succínico.

El documento US 2003/017559 da a conocer un método para producir ácido succínico a partir de hidrolizados de calidad industrial, que comprende suministrar un 10 organismo que contiene mutaciones para los genes ptsG, pflB y ldhA, permitir que dicho organismo acumule biomasa y permitir que dicho organismo metabolize el hidrolizado. Aunque se mencionan determinados mutantes de E. coli específicos (AFP 184 y AFP 400), ninguno de ellos eran accesibles al publico en el momento de la publicación del documento US 2003/017559. 15

El método anterior según el documento US 2003/017559, en el que se usa el mutante de E. coli AFP 184, se conoce también de la presentación oral de Nghiem et al. “Production of succinic acid from lignocellulosic materials” en la 221 reunión de la ACS, 2001, páginas 1-24.

Vemuri et al., “Succinate production in dual-phase Escherichia coli 20 fermentations depends on the time of transition from aerobic to anaerobic conditions”, Journal of Microbiology, vol. 28, 2002, páginas 325-332, da a conocer un método para producir ácido succínico a partir de medios a base de glucosa, usando el mutante de Escherichia coli AFP 111. Se da a conocer también un método similar en Vemuri et al., Appl. Environ. Microbiol. Abril de 2002, 68(4): 1715-27. 25

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método de producción de ácido succínico que supera muchas de las desventajas de la técnica anterior.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de 30 fermentación que produce altos rendimientos de ácido succínico.

Aún otro objeto de la presente invención es producir ácido succínico de manera fermentativa.

En resumen, se proporciona un método de producción de ácido succínico a partir de hidrolizados de calidad industrial según la reivindicación 1.

También se proporciona una bacteria mutante según la reivindicación 9.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS 5

La presente invención junto con los anteriores y otros objetos y ventajas pueden entenderse de la mejor manera a partir de la siguiente descripción detallada de la realización de la invención ilustrada en los dibujos, en la que:

la figura 1 es un gráfico que representa una producción potenciada de ácido succínico tras la transformación de una bacteria con un gen mutante, según 10 características de la presente invención;

la figura 2 es un gráfico que representa la fermentación del hidrolizado industrial a través de un organismo mutante triple, según características de la presente invención; y

La figura 3 es un gráfico que representa la fermentación de azúcar sintética a 15 través de un organismo mutante triple, según características de la presente invención.

DESCRIPCIÓN...

1. Método de producción de ácido succínico a partir de hidrolizados de calidad industrial que comprende :

a) suministrar un organismo de una cepa de Escherichia coli seleccionada de AFP 184 (ATCC PTA 5132), AFP 400 (ATCC PTA 5583) y AFP 404 5 (ATCC PTA 5133);

b) permitir que dicho organismo acumule biomasa; y

c) permitir que dicho organismo metabolize el hidrolizado.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la biomasa acumula entre aproximadamente 108 y 1011 células por mililitro. 10

3. Método según la reivindicación 1, en el que el hidrolizado de calidad industrial es hidrolizado lignocelulósico, o disoluciones de azúcar derivada de maíz.

4. Método según la reivindicación 1, en el que la temperatura se selecciona de entre aproximadamente 25ºC y 45ºC.

5. Método según la reivindicación 1, en el que la biomasa se acumula en una 15 atmósfera aerobia.

6. Método según la reivindicación, en el que el pH se selecciona de entre aproximadamente 5 y 9.

7. Método según la reivindicación 1, en el que el hidrolizado está contenido en una primera cantidad de materias primas y en el que el método se hace 20 continuo con la adición de una segunda cantidad de materias primas.

8. Método según la reivindicación 7, en el que se añade la segunda cantidad de materias primas cuando la concentración de ácido succínico es de aproximadamente 50 g/l.

9. Cepa mutante de Escherichia coli seleccionada de AFP 184 (ATCC PTA 5132), 25 AFP 400 (ATCC PTA 5583) y AFP 404 (ATCC PTA 5133), caracterizada porque produce ácido succínico a partir de sustrato contenido en hidrolizado de calidad industrial en una razón de entre 0,6:1 y 1,3:1 de ácido succínico con respecto al sustrato.

10. Mutante según la reivindicación 9, en el que el sustrato es un azúcar 30 seleccionado del grupo que consiste en glucosa, lactosa, sorbitol, xilosa, arabinosa, manosa, ácido glucorónico, galactosa, fructosa o combinaciones de los mismos.

11. Mutante según la reivindicación 9, en el que el mutante puede utilizar más de un sustrato simultáneamente para producir ácido succínico simultáneamente.