METODO PARA EL DIAGNOSTICO SEROLOGICO DE LA ENFERMEDAD DE PARKINSON.

Método de diagnóstico serológico de la enfermedad de Parkinson basado en la determinación de actividad de aminopeptidasas séricas utilizando sustratos de aminopeptidasas como reactivos mediante la medida de la fluorescencia o absorbancia producida por los productos obtenidos por la acción hidrolítica de tales enzimas

Método para el diagnóstico serológico de la enfermedad de Parkinson.

Sector de la técnica

Diagnóstico Clínico.

Estado de la técnica

Los enzimas proteolíticos son aquellos que catalizan la hidrólisis de los enlaces peptídicos. El término es básicamente sinónimo a los de proteasas, proteinasas y peptidasas, si bien este último se aplica preferentemente a aquellos enzimas que utilizan péptidos (breves cadenas de aminoácidos) como sustratos. Estos enzimas se suelen dividir en dos grupos: exopeptidasas y endopeptidasas. Los primeros hidrolizan enlaces próximos (uno o dos residuos) a los extremos de la cadena polipeptídica, mientras que las endopeptidasas actúan preferentemente sobre enlaces alejados de los extremos de dicha cadena. Debido a la amplia especificidad de substrato de muchos de estos enzimas y a la aparición de proteinasas que forman parte de complejos multicatalíticos (proteasomas), se tiende a agrupar a estos enzimas de acuerdo con su actividad más que a definirlas por sus características estructurales, ya que un mismo enzima puede actuar sobre diferentes substratos (Figura 1).

Las exopeptidasas que requieren un grupo alfa-amino libre de los péptidos se denominan aminopeptidasas (AP) si liberan aminoácidos individuales, dipeptidil aminopeptidasas, si liberan dipéptidos, y tripeptidil aminopeptidasas si liberan cadenas de tipéptidos. Además, las exopeptidasas que requieren un grupo carboxílico terminal no sustituido de los péptidos se denominan carboxipeptidasas, si liberan aminoácidos libres y dipeptidil carboxipeptidasas si liberan dipéptidos intactos.

Los nombres dados a la mayoría de las AP se basan frecuentemente en sus preferencias o requerimientos por un particular aminoácido N-terminal. Por ejemplo, un enzima que muestre su más alta tasa de hidrólisis sobre enlaces donde la alanina sea el aminoácido N-terminal se denominaría alanil aminopeptidasa (o alanina aminopeptidasa). Similarmente, los nombres aplicados a las carboxipeptidasas que liberan aminoácidos se utilizan para identificar sus requerimientos o preferencias por un residuo C-terminal.

Nuestro equipo de investigación ha observado que los niveles séricos de ciertas aminopeptidasas se alteran de manera significativa en pacientes con enfermedad de Parkinson. Estos enzimas tienen funciones reguladoras sobre diversos péptidos circulantes y además pueden ser útiles para el diagnóstico de enfermedades del sistema nervioso central. A continuación se describen algunas de ellos.

Alanina aminopeptidasa (AlaAP) (EC 3.4.11.14) (aminopeptidasa M). Cataliza la liberación de aminoácidos N-terminales de dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos y diferentes aminoacil-2-naftilamidas (arilamidas), con preferencia por derivados de la alanina, metionina, fenilalanina y en menor medida, otros aminoácidos. Se encuentra en gran cantidad de tejidos y fluidos corporales y su pH óptimo es de 7.4. Varios isoenzimas órgano-específicos se localizan en suero. La mayoría de la actividad circulante se cree que procede del hígado, mientras que la actividad encontrada en orina, parece que tiene su origen en el riñón. Sus niveles séricos están elevados en ciertas patologías, como adenocarcinoma de colon y páncreas, síndrome nefrótico y también en el embarazo. Su actividad aumenta también significativamente en enfermedades hepato-biliares. Además la AlaAP puede hidrolizar bradicinina, encefalinas y también ha sido descrita como actividad angiotensinasa. La AlaAP está elevada durante la infancia y disminuye después de la pubertad. Sus valores son mayores en hombres que en mujeres y se ha descrito que su actividad se incrementa con el consumo de alcohol, drogas y tabaco.

Cistina aminopepidasa (CysAP) (EC 3.4.11.3) hidroliza los enlaces peptídicos entre una cistina N-terminal y el residuo adyacente. En el caso de la oxitocina, su presunto sustrato fisiológico, el residuo adyacente es la tirosina. Por la acción de éste enzima se destruye la actividad biológica de esta hormona neurohipofisaria. Exhibe una amplia especificidad sobre diferentes aminoacil-2-naftilamidas. Es insensible a la bestatina y a aminoácidos hidrofóbicos, a diferencia de otras AP séricas. Se ha localizado exclusivamente en el plasma de mujeres embarazadas y en la placenta humana y de otros primates. Sin embargo, el suero fetal y el fluido amniótico están libres de esta actividad enzimática. Sólo se han encontrado trazas en sangre de mujeres no embarazadas y ninguna en sangre de hombres. La placenta es una fuente rica en enzimas, pero la cistinil aminopeptidasa es una de las pocas relativamente específicas de este tejido. Se cree que estos niveles elevados de CysAP son los responsables de prevenir un comienzo prematuro de las contracciones uterinas mediante la destrucción de la oxitocina. En los embarazos anormales, el aumento de la actividad de CysAP es a menudo inadecuado y errático. Cada vez se piensa más que la medida de actividad de CysAP sérica en mujeres embarazadas durante el curso de su embarazo puede servir como indicador de la función feto-placentaria y su desarrollo, y que esta medida podría reemplazar otros métodos laboriosos que requieren la determinación de estrógenos totales urinarios o de pregnandiol. En este sentido, la aspartato aminopeptidasa, que también posee actividad angiotensinasa, muestra un descenso significativo en casos de pre-eclampsia. También se ha descrito que la CysAP aumenta en sueros de mujeres con adenocarcinoma ovárico, pero esto no está del todo demostrado. Hay que indicar además, que se ha descrito la actuación de la CysAP sobre la vasopresina neurohipofisaria, aunque también podríamos sugerir su actuación sobre otros péptidos cuyo residuo N-terminal es la cistina, como es el caso de las endotelinas.

Glutamato aminopeptidasa (GluAP) (EC 3.4.11.7) (aminopeptidasa A) (angiotensinasa A). Cataliza específicamente la hidrólisis de residuos no sustituidos de Glutamil- y Aspartil-2-naftilamidas y de péptidos. Se inhibe por agentes quelantes como EDTA y EGTA así como por amastatina. También la inhiben Zn²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺ y Hg²⁺. Es activada por Mn²⁺ y Ca²⁺ y ligeramente por Mg²⁺ y su pH óptimo es de 7.5. Se encuentra en suero y diferentes órganos de animales y es probablemente la aminopeptidasa responsable de la rápida destrucción de la angiotensina II. El incremento de la angiotensinasa observado durante el embarazo puede atribuirse probablemente al aumento de la síntesis de este enzima por la placenta. La aminopeptidasa A parece estar fundamentalmente unida a membrana y muy distribuida en tejidos corporales pero es especialmente abundante a nivel renal. La única aminopeptidasa que ha sido descrita como específica para aminoácidos dicarboxílicos es la GluAP y no hidroliza derivados de arilamidas que contengan aminoácidos diferentes al glutámico o al aspártico, siendo esta actividad extensible a las angiotensinas naturales.

Aspartato aminopeptidasa (AspAP) (EC 3.4.11.-) (angiotensinasa). Cataliza la hidrólisis del aminoácido N-terminal de péptidos y arilamidas, siempre que éste sea un aminoácido dicarboxílico. Los restos aspartilos son hidrolizados más rápidamente que los restos glutamilos y no afecta a otros aminoácidos. Tiene un pH óptimo de actuación, de 7.5 y es activada por Mn²⁺, pero, a diferencia de la GluAP, no se afecta por Ca²⁺, ni es inhibida por EDTA. Al igual que la GluAP, la AspAP parece ser un enzima fundamentalmente unido a membrana y muy abundante a nivel renal. Su rápida acción sobre los residuos de ácido aspartilos N-terminales de los péptidos sugiere, al igual que la GluAP, una posible función fisiológica en la degradación de la angiotensina II y su conversión en angiotensina III. Pero además, la AspAP tiene el potencial de actuar sobre residuos de Asp amino-terminales de péptidos diferentes a la Ang II, como podrían ser el octapéptido colecistocinina (26-33) o el tetrapéptido colecistocinina (26-29). Por último, como señalábamos anteriormente, la aspartato aminopeptidasa muestra un descenso significativo en casos de pre-eclampsia.

Los enzimas proteolíticos gozan de un interés muy extendido entre la comunidad científica debido a que pueden ser utilizados como herramientas muy valiosas desde diversos puntos de vista. Para los químicos y clínicos, las proteasas son herramientas o sondas para estudiar la estructura de las proteínas, o para relacionarlas con procesos patológicos. Para los bioquímicos o fisiólogos, su interés se dirige hacia el estudio de las propiedades intrínsecas de éstos enzimas y para el...

1. Método de diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas que utiliza la determinación de la actividad de aminopeptidasas séricas para el diagnóstico caracterizado por utilizar aminoacil-2-naftilamidas como reactivos de diagnóstico.

2. Método de diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas caracterizado por utilizar aminoacil-2-naftilamidas como reactivos de diagnóstico mediante la detección de la fluorescencia de la 2-naftilamina liberada por la acción hidrolítica de aminopeptidasas.

3. Método de diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas según reivindicaciones anteriores, caracterizado porque una disolución en dimetilsulfóxido del sustrato empleado, debidamente suplementada, se mezcla con la cantidad apropiada de suero o plasma a analizar, incubando a una temperatura de entre 20º y 40ºC un tiempo adecuado, tras el cual se detiene la reacción por adición de buffer acetato.

4. Kit de diagnóstico serológico de la enfermedad de Parkinson que comprende los siguientes componentes:

a. Aminoacil-2-naftilamidas

b. Albúmina bovina

c. Ditiotreitol (DTT)

d. Cloruro cálcico (Ca Cl₂)

e. Cloruro de manganeso (Mn Cl₂)

f. Tampón Fosfato 50 mM (pH 7.4)

g. Tampón Tris HCl 50 mM (pH 6)

h. Tampón Tris HCl 50 mM (pH 7.4)

i. Tampón acetato 0.1 M (pH 4.2).