Un procedimiento para obtener una toxina botulínica biológicamente activa,

que comprende las etapas de:

(a)proporcionar un medio de fermentación que esté exento de un producto derivado de un animal, comprendiendo el medio de fermentación soja hidrolizada,

(b)cultivar una bacteria Clostridium botulinum en el medio de fermentación en condiciones que permitan la producción de una toxina botulínica, y

(c)recuperar una toxina botulínica biológicamente activa del medio de fermentación

Medios exentos de producto animal y procedimientos para obtener una toxina botulínica.

Antecedentes

La presente invención se refiere a un medio y a un procedimiento para obtener toxina botulínica biológicamente activa. En particular, la presente invención se refiere a medios, cultivos y procedimientos de fermentación anaeróbica, sustancialmente libres de producto animal, de un organismo tal como la bacteria botulínica Clostridium, para obtener abundante toxina botulínica biológicamente activa.

Una composición farmacéutica adecuada para administración a un ser humano para una finalidad de investigación, terapéutica, diagnóstica o cosmética puede comprender un ingrediente activo. La composición farmacéutica puede comprender también uno o varios excipientes, tampones, vehículos, estabilizadores conservantes y/o agentes que confieren volumen. El ingrediente activo en una composición farmacéutica puede ser un ingrediente biológico tal como una toxina botulínica. La toxina botulínica se puede obtener por un procedimiento de cultivo, fermentación y composición que hace uso de uno o varios productos derivados de animales (tal como un medio de cultivo de caldo de carne y una fracción de sangre o un excipiente derivado de sangre). La administración a un paciente de una composición farmacéutica cuyo ingrediente biológico activo se obtiene por un procedimiento que hace uso de productos derivados de animales puede someter al paciente al riesgo potencial de recibir diversos patógenos o agentes infecciosos. Por ejemplo, en una composición farmacéutica pueden estar presentes priones. Un prión es una partícula infecciosa proteinácea que se supone que surge como isomorfo de conformación anormal de la misma secuencia de ácido nucleico que hace la proteína normal. Se ha supuesto hipotéticamente además que la capacidad de infección reside en una "reacción de reclutamiento" de la proteína isomorfa normal al isomorfo de la proteína de prión a un nivel postdireccional. Aparentemente, la proteína celular endógena normal es inducida a un plegamiento anormal en una conformación patógena de prión.

La enfermedad de Creutzfeld-Jacob es un raro trastorno neurodegenerativo de encefalopatía humana espongiforme transmisible en la que el agente transmisible aparentemente es un isomorfo anormal de una proteína de prión. Un individuo con enfermedad de Creutzfeld-Jacob puede deteriorarse desde una salud aparentemente perfecta a un mutismo acinético en seis meses. Así, puede existir riesgo potencial de adquirir una enfermedad mediada por prión, tal como la enfermedad de Creutzfeld-Jacob, por administración de una composición farmacéutica que contenga un agente biológico, tal como una toxina botulínica, obtenida usando productos derivados de animales.

Toxina botulínica

El género Clostridium tiene más de 127 especies agrupadas por morfología y función. La bacteria anaeróbica, gram positiva, Clostridium botulinum produce una potente neurotoxina polipeptídica, toxina botulínica, que causa una enfermedad neuroparalítica en seres humanos y animales, denominada botulismo. Comúnmente, la Clostridium botulinum y sus esporas se encuentran en el suelo y la bacteria puede crecer en recipientes de alimentos inadecuadamente esterilizados y cerrados de conservas domésticas, que son la causa de muchos de los casos de botulismo. Los efectos del botulismo típicamente se manifiestan de 18 a 36 horas después de comer los alimentos infectados con un cultivo o con esporas de Clostridium botulinum. La toxina botulínica aparentemente puede pasar no atenuada a través del revestimiento del intestino y atacar neuronas periféricas motoras. Los síntomas de intoxicación por la toxina botulínica pueden evolucionar desde dificultad al andar, tragar y hablar a la parálisis de los músculos respiratorios y la muerte.

El tipo A de toxina botulínica es el agente biológico natural más letal conocido para el hombre. Aproximadamente, 50 picogramos de toxina botulínica de tipo A (complejo de neurotoxina purificado) es DL₅₀ en ratones. Sobre base molar, el tipo A de toxina botulínica es 1,8 mil millones de veces más letal que la difteria, 600 millones de veces más letal que el cianuro sódico, 30 millones de veces más letal que la cobratoxina y 12 millones de veces más letal que el cólera. Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, págs. 63-84 (capítulo 4) de Natural Toxins 11, editado por B.R. Singh y otros, Plenum Pres, New York (1976) (donde la DL₅₀ del tipo A de la toxina botulínica de 0,3 ng igual a 1 se corrige por el hecho de que aproximadamente 0,05 ng de BOTOX® es igual a 1 unidad). BOTOX ® es la marca comercial del complejo del tipo A de toxina botulínica disponible comercialmente en Allergan, Inc., de Irvine, California. Una unidad (U) de toxina botulínica se define como DL₅₀ después de inyección peritoneal en ratones hembra Swiss Webster con un peso de 18-20 g cada uno. Con otras palabras, una unidad de toxina botulínica es la cantidad de toxina botulínica que mata 50% de un grupo de ratones hembra Swiss Webster. Se han caracterizado siete neurotoxinas botulínicas en general inmunológicamente distintas que son, respectivamente, los serotipos A, B, C₁, D, E, F y G, cada una de las cuales se distingue por neutralización con anticuerpos específicos para el tipo. Los diferentes serotipos de toxina botulínica varían en cuanto a la especie animal a que afectan y la gravedad y la duración de la parálisis que inducen. Por ejemplo, se ha determinado que el tipo A de toxina botulínica es 500 veces más potente, según es ha determinado por el grado de parálisis producido en ratas, que el tipo B de toxina botulínica. Además, se ha determinado que el tipo B de toxina botulínica es no tóxico en primates a una dosis de 480 U/kg, que es aproximadamente 12 veces la DL₅₀ de primates para el tipo A de toxina botulínica. Al parecer, las toxinas botulínicas se unen con gran afinidad a las neuronas motoras colinérgicas, se translocalizan en la neurona y bloquean la liberación presináptica de acetilcolina.

Las toxinas botulínicas se han utilizado en series clínicas para el tratamiento de, por ejemplo, trastornos neuromusculares caracterizados por músculos esqueléticos hiperactivos. El tipo A de toxina botulínica ha sido aprobado por la U.S. Food and Drug Administration para el tratamiento de blefaroespasmos esenciales, estrabismo y espasmo hemifacial en pacientes de más de 12 años, para el tratamiento de la distonía cervical y para el tratamiento de la arruga del entrecejo (facial). La FDA ha aprobado también un tipo B de toxina botulínica para el tratamiento de la distonía cervical. Los efectos clínicos de la inyección periférica (esto es, intramuscular o subcutánea) del tipo A de toxina botulínica usualmente se ven antes de una semana después de la inyección y frecuentemente al cabo de unas pocas horas después de la inyección. La duración típica de la mitigación sintomática (esto es, parálisis de músculo flácido) de una sola inyección del tipo A de toxina botulínica puede ser de aproximadamente tres meses a aproximadamente seis meses.

Aunque aparentemente todos los serotipos de toxinas botulínicas inhiben la liberación de acetilcolina neurotransmisora en la conexión neuromuscular lo hacen afectando a diferentes proteínas neurosecretoras y/o a la escisión de estas proteínas en diferentes sitios. El tipo A de toxina botulínica es una endopeptidasa de zinc que puede hidrolizar específicamente una unión de péptido de la proteína SNAP-25 intracelular asociada a la vesícula intracelular asociada. El tipo E de toxina botulínica también escinde la proteína asociada sinaptosómica de 25 kilo Dalton (kD) (SNAP-25), pero también selecciona diferentes secuencias de aminoácidos dentro de esta proteína, en comparación con la toxina A Los tipos B, D, F y G de toxina botulínica actúan sobre la proteína asociada a vesícula (VAMP, también denominada sinaptobrevina), escindiendo cada serotipo la proteína en un sitio diferente. Finalmente, el tipo C₁ de resina botulínica ha demostrado que escinde sintaxina y SNAP-25, ambas. Estas diferencias del mecanismo de acción pueden afectar a la potencia relativa y/o la duración de la acción de los diversos serotipos de toxina botulínica.

Independientemente del serotipo, el mecanismo molecular de la intoxicación de la toxina parece que es similar e implica como mínimo tres etapas. En la primera etapa del proceso, la toxina se une a la membrana presináptica de la neurona diana por interacción específica entre la cadena pesada (cadena H) y un receptor...

1. Un procedimiento para obtener una toxina botulínica biológicamente activa, que comprende las etapas de:

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que, en la etapa de cultivo, el cultivo se realiza hasta que la densidad de células del cultivo disminuye debido a la lisis celular.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que, en la etapa de cultivo, el cultivo se realiza hasta como mínimo 48 horas después de la caída inicial de la densidad de células debido a la lisis celular.

4. Un procedimiento para la producción de una toxina botulínica, procedimiento que comprende las etapas de:

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que, en la etapa de cultivar una Clostridium botulinum en el primer medio, las condiciones comprenden una temperatura de aproximadamente 34ºC y que además comprende no disminuir la densidad de células durante el cultivo, en el que, en la etapa de inocular un segundo medio con un primer medio, para inocular el segundo medio se usa de 2 a 4% del primer medio, y

en el que, en la etapa de cultivar la bacteria en el segundo medio, las condiciones que permiten el crecimiento comprenden una temperatura de aproximadamente 34ºC y además comprenden cultivar hasta que la densidad de células en el cultivo disminuye debido a la lisis celular.

6. Una composición que comprende (i) una Clostridium botulinum y (ii) un medio de cultivo para producir una toxina botulínica, en la que el medio está sustancialmente exento de un producto derivado de un animal y comprende soja hidrolizada.

7. Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica exenta de producto animal en la que el ingrediente activo es una toxina botulínica, procedimiento que comprende las etapas de: