Manipulación en la función de AtDPB1 para generar resistencia frente a potyvirus.

La presente invención se refiere a la utilización de una mutación para la generación de plantas mutantes resistentes a virus, concretamente la utilización de la mutación 8.1 del gen AtDBP1 de la Arabidopsis thaliana para modificar el fenotipo de la planta como regulador de la resistencia en plantas frente a potyvirus, así como las plantas obtenidas genéticamente modificadas cuya resistencia a la infección frente al potyvirus es mayor que en las plantas sin modificar

Manipulación en la función de AtDBP1 para generar resistencia frente a potyvirus.

Sector técnico de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de una mutación para la generación de plantas mutantes resistentes a virus, concretamente la utilización de la mutación 8.1 del gen AtDBP1 de Arabidopsis thaliana como regulador de la resistencia en plantas frente a potyvirus para modificar el fenotipo de la planta, así como las plantas obtenidas genéticamente modificadas cuya resistencia a la infección frente al potyvirus es mayor que en las plantas sin modificar.

Antecedentes de la invención

En la naturaleza, todos los organismos vivos han de estar continuamente defendiéndose de su interacción con otros seres para su supervivencia. Las plantas coexisten con multitud de microorganismos patógenos como bacterias, virus, hongos, etc., sin embargo, en el mundo vegetal, la enfermedad constituye una excepción y ello se debe a los múltiples mecanismos de defensa que las plantas poseen frente a estos patógenos. Algunos de estos mecanismos son constitutivos, estando establecidos en la planta antes de la llegada del patógeno; mientras que otros se inducen tras la percepción del mismo y proporcionan protección no sólo en el sitio de infección sino sistémicamente a lo largo de toda la planta (Dempsey, D.A., Shah, J. and Klessig, D.F. (1999). Salicylic acid and disease resistance in plants. Crit. Rev. Plant Sci. 18, 547-575).

El conocimiento de las rutas de señalización implicadas en la respuesta defensiva y los procesos que subyacen a la interacción entre la planta y el patógeno, representa un indudable interés tanto básico como aplicado. Esto facilitaría el diseño de estrategias encaminadas a la obtención de variedades vegetales de mayor resistencia a patógenos, así como también el control de las enfermedades en las especies cultivables para aumentar el rendimiento, la calidad y la seguridad de la cosecha ya que se estima que las pérdidas de rendimiento por causas debidas a patógenos representan alrededor del 10-20% (Kreps, J.A., Yajun, W., Chang, H.-S., Zhu, T., Wang, X. and Harper, J.F. (2002). Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic, and cold stress. Plant Physiol. 130, 2129-2141).

Las enfermedades que causan los virus en las plantas pueden dañar las hojas, los tallos, las raíces, los frutos, las semillas o las flores, y son responsables de un porcentaje considerable de las pérdidas económicas debidas a la reducción del rendimiento en las cosechas y en la calidad (Agrios, "Chapter 14: Plant diseases caused by viruses" (1988), Plant Pathology, 3rd Ed., San Diego, CA, Academic Press, p.655). Por esto, los virus de plantas se consideran la mayor amenaza para la agricultura moderna, provocando bajas en la productividad y productos imperfectos o de baja calidad en muchos cultivos y plantas ornamentales en todo el mundo. Dado el carácter generalizado y persistente de las enfermedades provocadas por estos patógenos, se hace necesario establecer métodos de control adecuados para prevenir infecciones, proteger los cultivos y minimizar así las pérdidas agrarias.

Los virus de plantas se clasifican en virus de RNA y virus de DNA según la naturaleza de su material genético, siendo los de RNA de cadena sencilla y polaridad positiva los más frecuentes (Hull, R. (2002). Matthews' Plant Virology. Academic Press). La infección se produce a través de heridas causadas por daños físicos debidos al medio ambiente o por la acción de vectores como insectos, ácaros, nemátodos y ciertos hongos habitantes del suelo. En el citoplasma, el virus de RNA se desensambla, se replica, traduce sus mensajeros a proteínas y se moviliza local y sistémicamente (Stange, C. (2006). Plant-virus interactions during the infective process. Cien. Inv. Agr. 33, 1-18). Para poder reproducirse, el virus utiliza energía y proteínas de la célula hospedadora. Durante cada etapa del ciclo viral se generan complejas interacciones entre la planta hospedadora y el virus, que están siendo objeto de intenso estudio en los últimos años. Por ejemplo ciertos componentes de la planta hospedadora como microtúbulos, filamentos de actina/miosina y calreticulina facilitan la infección y el movimiento del virus en la planta (Boevnik, P. and Oparka, K.J. (2005). Virus-host interactions during movement processes. Plant Physiol. 138, 1815-1821; Chen, M.-H., Tian, G.-W., Gafni, Y. and Citovsky, V. (2005). Effects of calreticulin on viral cell-to-cell movement. Plant Physiol. 138, 1866-1876). Sin embargo, aún se desconoce la identidad de todos los factores, inherentes al hospedador, involucrados en el ciclo viral. Sin duda su conocimiento es uno de los mayores desafíos que tiene planteado el campo de la virología con las miras puestas en generar resistencias a infecciones víricas en cultivos de interés económico y medioambiental.

Frente a la lentitud y la complejidad de los programas de mejora genética clásica, se han desarrollado estrategias biotecnológicas basadas en la obtención de plantas transgénicas para generar resistencia a infecciones virales. En este sentido, el concepto de resistencia derivada del virus propuesto por Sanford y Johnston (Sanford, J.C. and Johnston, S.A. (1985). The concept of parasite-derived resistance: driving resistance genes from the parasites own genome. J. Theor. Biol. 115, 395-405) es el que se ha empleado con mayor éxito y se basa en la expresión en la planta de genes virales. Ello podría interferir con el ciclo viral o activar mecanismos de silenciamiento génico. El silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS), también conocido como silenciamiento de RNA, es un mecanismo fundamental de defensa antiviral en plantas. Es un proceso de control de la expresión génica a nivel post-transcripcional que conduce a la supresión de elementos genéticos foráneos como virus y transposones a través de un mecanismo específico de degradación de RNA (Baulcombe, D. (2004). RNA silencing in plants. Nature 431, 356-363; y Trenes Biochem. Baulcombe, D. (2005). RNA silencing. Trends Biochem. Sci. 30, 290-293).

En los organismos vegetales se conocen al menos tres vías para el silenciamiento de RNA: el silenciamiento citoplasmático por RNAs pequeños interferentes (siRNA), el silenciamiento de mRNA endógenos por microRNA (miRNA) y el silenciamiento asociado a la metilación de DNA y supresión de la transcripción. Todas estas vías implican la rotura de moléculas de RNA de doble cadena (dsRNA) en RNAs pequeños tales como siRNA y miRNA. (Baulcombe, D. (2004). RNA silencing in plants. Nature 431, 356-363). Entre las limitaciones que presentan las tecnologías basadas en el silenciamiento de RNA cabe destacar el requerimiento de una alta especificidad de secuencia para la degradación de RNA (Ritzenthaler, C. (2005). Resistance to plant viruses: old issue, news answers? Curr. Opin. Biotechnol. 16, 118-122). Además, los virus han desarrollado la capacidad de codificar supresores de este mecanismo de defensa antiviral innato. De entre las proteínas supresoras, la HCPro (helper component-protease) codificada por los potyvirus (y Vance, V. and Vaucheret, H. (2001). RNA silencing in plants-defense and counterdefense. Science 292, 2277-2280) ha sido una de las más estudiadas. Por todo ello, la aplicación de estas estrategias podría ser limitada y poco eficaz en generar resistencia frente un amplio rango de virus.

En otros casos, se ha recurrido a la expresión de genes de resistencia de la planta o genes R. Estos genes son los responsables del reconocimiento del invasor mediante la interacción directa o indirecta del producto de su expresión con factores de avirulencia (Avr) del patógeno. Dicho reconocimiento desencadena un programa de muerte celular en el sitio de infección o reacción hipersensible que bloquea la dispersión del patógeno y conduce a la activación de la respuesta defensiva. Se han identificado genes de resistencia a determinados virus en diferentes especies vegetales, tal como el gen N de tabaco (Nicotiana tabacum), el cual confiere resistencia frente al virus del mosaico del tabaco (TMV), siendo un modelo clásico en el estudio de las interacciones planta-virus (Whitham, S., Dinesh-Kumar, S.P., Choi, D., Hehl, R., Corr, C. and Baker, B. (1994). The product of the tobacco mosaic virus resistance gene N: similarity to TOLL and the Interleukin-1 receptor. Cell 78, 1101-1115; y Whitham, S., McCormick, S. and Baker, B. (1996). The N gene of tobacco confers resistance to tobacco...

1. Uso del gen AtDBP1 en especies vegetales como regulador de la respuesta de las plantas frente a la infección por potyvirus.

2. Uso del gen AtDBP1 según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha regulación consiste en conferir resistencia o un aumento de resistencia a la infección por potyvirus comparada con las plantas de tipo salvaje.

3. Uso del gen AtDBP1 según las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque la resistencia o mayor resistencia a la infección por potyvirus se produce por pérdida de función del gen AtDBP1.

4. Uso del gen AtDBP1 según las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la pérdida de función es por inhibición de su expresión.

5. Uso del gen AtDBP1 según las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la inhibición de su expresión es producida por la mutación 8.1.

6. Uso del gen AtDBP1 según las reivindicaciones 1-5, caracterizado por producir una menor acumulación de elF(iso)4e.

7. Uso del gen AtDBP1 según las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el potyvirus es Plum Pox Virus (PPV).

8. Uso del gen AtDBP1 según las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque el potyvirus es Turnip Mosaic Virus (TuMV).

9. Uso del gen AtDBP1 según las reivindicaciones 1 -8, para la obtención de plantas trasgénicas resistentes o que presenten mayor resistencia a la infección por potyvirus.

10. Uso del gen AtDBP1 según las reivindicaciones 1-9, para la obtención de plantas trasgénicas resistentes o que presenten mayor resistencia a la infección por potyvirus.

11. Plantas modificadas genéticamente, según las reivindicaciones 1-10, caracterizadas por su pérdida de función del gen AtDBP1 para generar resistencia a la infección por potyvirus.

12. Planta modificada genéticamente según reivindicación 11 caracterizada porque la pérdida de función del gen AtDBP1 es producida por la mutación 8.1.