MANGANEXO SUPEROXIDO DISMUTASA HUMANA MODIFICADA Y SUS USOS.
Un procedimiento para la preparación de una manganeso dismutasa humana segregada (hMnSOD),
que comprende las siguientes etapas:
i) crecimiento de células LSA (número de depósito DSMZ 2029) en medio exento de proteínas durante al menos 24 horas y la recolección del medio acondicionado;
ii) purificación de la manganeso superóxido dismutasa a partir del medio acondicionado por cromatografía de inmunoafinidad con un anticuerpo anti-hMnSOD
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W0302017EP.
Solicitante: MANCINI, ALDO.
Nacionalidad solicitante: Italia.
Dirección: VIA F. VERROTTI, 4,80128 NAPOLI.
Inventor/es: MANCINI,ALDO.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 2 de Septiembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K8/66 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 8/00 Cosméticos o preparaciones similares para el aseo. › Enzimas.
- A61Q19/00 A61 […] › A61Q USO ESPECIFICO DE COSMETICOS O DE PREPARACIONES SIMILARES PARA EL ASEO. › Preparaciones para el cuidado de la piel.
- A61Q19/08 A61Q […] › A61Q 19/00 Preparaciones para el cuidado de la piel. › Preparaciones antienvejecimiento.
- C12N9/02M
Clasificación PCT:
- A61K38/44 A61K […] › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Oxidoreductasas (1).
- A61P35/00 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › Agentes antineoplásicos.
- C12N9/02 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa.
Clasificación antigua:
Fragmento de la descripción:
Manganeso superóxido dismutasa humana modificada y sus usos.
Estado de la técnica
Los radicales superóxido, especies de oxígeno muy reactivas, se generan en células aeróbicas como productos de desecho del metabolismo oxidativo y, si se acumulan en cantidades excesivas, pueden provocar daños irreversibles en las estructuras esenciales para la función celular. En condiciones fisiológicas, las células están protegidas de estos compuestos por un grupo de metaloproteínas, la superóxido dismutasa, que cataliza la dismutación de radicales superóxido a peróxido de hidrógeno, que se convierte en oxígeno molecular mediante la acción de la catalasa. Los diversos tipos de superóxido dismutasa difieren entre sí en la porción metálica y/o proteica. En células eucariotas, se han identificado la superóxido dismutasa de cobre/cinc (SOD Cu/Zn), localizada principalmente en el citoplasma, y la superóxido dismutasa extracelular (ECSOD) y la manganeso superóxido dismutasa (MnSOD), con localización principalmente mitocondrial. Las superóxido dismutasas son enzimas de notable interés farmacológico por su potencial papel en la prevención y reparación de todas las patologías que implican un daño oxidativo. Como ejemplo, se ha propuesto que estas enzimas pueden ser útiles en la prevención de tumores, en la prevención de daños que derivan de la reperfusión de tejidos isquémicos, en el tratamiento de estados inflamatorios, en la prevención y tratamiento de daños que derivan de radiaciones UV, y en la reducción de efectos citotóxicos y cardiotóxicos de terapias anti- tumorales.
Por ejemplo, Zhong W. y col. en Oncogene, 1997, 14: 481-490 describe que la sobreexpresión de MnSOD reduce el fenotipo maligno en una línea celular de glioma humano (U118) y Wispe J.R. y col. en Biochimica et Biophysica Acta, 1989, 30-36 describe la expresión recombinante de ADNc de MnSOD y la purificación de MnSOD a partir de hígado de conejo.
La manganeso superóxido dismutasa es de interés terapéutico particular por su localización en la mitocondria, conocida por representar la fuente endógena principal de radicales superóxido. La secuencia completa del ADNc de la manganeso superóxido dismutasa fue identificada en los 80 y se encuentra en SwissProt con el número de acceso P04179 (Beck y col., Nucleic Acid Res. 16(13) 6224, 1988) y en el GenBank con el número de acceso NM_00636. La proteína codificada por el ADNc ha sido identificada, entre otros, por Wispè y col. Biochim. Biophyis. Acta, 1989, 994: 30-36.
Posteriormente se han descrito numerosas variantes alélicas de esta enzima y han sido revisadas con el número de acceso en el GenBank.
Después de la identificación de los genes, debido a su potencial interés terapéutico, se han establecido diversos procedimientos para obtener la manganeso superóxido dismutasa humana por medio de técnicas recombinantes, como por ejemplo, aquéllas descritas en la patente EP0284105 o en la patente de EE.UU. 5246847.
En la solicitud de patente WO/18147, enviada por el solicitante, se ha descrito una nueva línea celular derivada de liposarcoma humano, denominada LSA, que produce una proteína capaz de inhibir selectivamente la división celular de células tumorales epiteliales sensibles a estrógenos. Además, se ha descrito una nueva proteína, denominada p1LSA, con una secuencia de aminoácidos homóloga a la de la proteína (de choque térmico) Hsp27.
Resumen de la invención
Los autores de la presente invención sorprendentemente han encontrado que se puede purificar una proteína con actividad citotóxica contra células tumorales a partir del medio acondicionado por células LSA. La proteína purificada es reconocida por anticuerpos anti-manganeso superóxido dismutasa humana (hMnSOD), pero a diferencia de la hMnSOD de tipo silvestre, se segrega en lugar de estar principalmente localizada en la mitocondria. Adicionalmente, dicha proteína está caracterizada por un peso molecular diferente de la proteína de tipo silvestre y que abarca entre 28-33 kDa en SDS-PAGE.
Además, el autor de la presente invención ha encontrado que la nueva hMnSOD obtenida a partir del medio de cultivo celular, no sólo es capaz de una actividad citotóxica selectiva y específica contra células tumorales, sino que también estimula la curación de lesiones cutáneas provocadas por agresiones químicas, físicas o biológicas.
La presente invención se refiere a un procedimiento simple y barato para purificar la hMnSOD anteriormente mencionada a partir del medio acondicionado procedente de células LSA mediante etapas secuenciales de cromatografía en columna.
Además, la presente invención se refiere a compuestos farmacéuticos que contienen la hMnSOD modificada de la invención para la prevención y terapia de tumores, para la curación de úlceras y lesiones cutáneas o para la prevención y tratamiento de lesiones por radiación ionizante.
Descripción de las figuras
La Figura 1 representa una SDS-PAGE (carriles 1 y 2) y una transferencia de Western (carriles 3 a 6) llevadas a cabo en condiciones reductoras y colocadas juntas. Para teñir las proteínas se usó Gold-Comassie después de la SDS-PAGE. Carril 1: marcadores de pesos moleculares, carril 2: medio de cultivo celular acondicionado concentrado a 100x en tampón fosfato a pH 7,4 (tampón fosfato salino). Para la transferencia de Western, se usó para la detección un anticuerpo de oveja anti-hMnSOD (Calbiochem) (carriles 3, 4, 5 y 6). Carriles 3 y 4: preparación de la MnSOD humana modificada según la invención (carril 3) o después del tratamiento con un anticuerpo anti-hMnSOD y Proteína-G-Sepharose (carril 4), carril 6: paso a través de la segunda columna de Q-Sepharose, carril 7: paso a través de la columna Sephacryl-75.
La Figura 2 SDS-PAGE de mhMnSOD purificada cromatográficamente por FPLC. El sobrenadante acondicionado del LSA se concentró 10X y se cargó en SDS-PAGE (carril 2); Carril 1: marcadores de pesos moleculares con unos pesos moleculares que corresponden, de arriba abajo a: 97, 31,5, 21,5, 16,5 kDa. Carril 3 y 4: mhMnSOD tal y como eluye después de la primera etapa cromatográfica (Q-Sepharose); carril 5 y 6: mhMnSOD tal y como eluye después de la etapa de filtración en gel (S-75); carril 7 y 8: mhMnSOD tal y como eluye después de la segunda etapa cromatográfica (Q-Sepharose); carril 9: transferencia de Western con un anticuerpo de oveja anti-hMnSOD realizada después de la cromatografía.
La Figura 3 Caracterización biológica de las fracciones cromatográficas. Se muestran células MCF7 después de 24 horas de incubación en presencia de: (A) paso a través de la segunda columna de Q-Sepharose (B) una muestra procedente de las fracciones que contienen la hMnSOD modificada eluida de la segunda columna de Q-Sepharose (C) una muestra de las fracciones eluida de la segunda columna de Q-Sepharose y que no contiene la hMnSOD.
La Figura 4 Efecto antitumoral in vivo de la mhMnSOD. Se muestra la diferencia en el crecimiento de tumor de mama en un ratón BalbC-F-C3H sin tratar (panel A superior) o tratado con la hMnSOD modificada de la invención (panel B inferior). En particular, no se produjo un incremento de la masa tumoral entre 1 y 4 cm de diámetro (panel A) cuando un tumor del mismo diámetro inicial se trató durante 15 días con la hMnSOD modificada de la invención (panel B): la masa del tumor no pareció aumentar y el tejido tumoral era completamente necrótico.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a la preparación de una manganeso superóxido dismutasa humana modificada que se segrega.
En el presente documento "superóxido dismutasa" designa una enzima capaz de catalizar la reacción de dismutación de radicales superóxido a peróxido de hidrógeno y oxígeno muscular.
En el presente documento "manganeso superóxido dismutasa humana" designa una metaloproteína capaz de formar complejos con manganeso, compuesta de una o más cadenas polipeptídicas, en la que el monómero tiene la secuencia de aminoácidos depositada en el GenBank con el número de acceso P04179 (Beck y col., Nucleic Acid Res. 16(13) 6224, 1988) y en el GenBank con el número de acceso NM_00636. El ADNc que codifica la proteína ha sido identificado, entre otros, por Wispè y col. Biochim. Biophyis. Acta, 1989, 994: 30-36. La forma madura de esta MnSOD humana, en lo sucesivo denominada hMnSOD o hMnSOD "tipo silvestre" tiene un peso molecular de 24 kDa aproximadamente.
La "manganeso superóxido dismutasa humana modificada", en lo sucesivo denominada...
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento para la preparación de una manganeso dismutasa humana segregada (hMnSOD), que comprende las siguientes etapas:
- i) crecimiento de células LSA (número de depósito DSMZ 2029) en medio exento de proteínas durante al menos 24 horas y la recolección del medio acondicionado;
- ii) purificación de la manganeso superóxido dismutasa a partir del medio acondicionado por cromatografía de inmunoafinidad con un anticuerpo anti-hMnSOD.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1 en el que dicha etapa ii) comprende las siguientes operaciones:
- a) concentración opcional del medio acondicionado con células LSA en un tampón con un pH entre 6 y 9;
- b) aplicación del medio acondicionado concentrado a una columna cromatográfica de intercambio iónico que tiene como fase estacionaria un grupo de intercambio aniónico fuerte y la elución con un gradiente salino lineal en tampón con un pH entre 6 y 9;
- c) identificación y recolección de las fracciones que contienen la manganeso superóxido dismutasa humana modificada;
- d) reunión de las fracciones recogidas y su carga en una columna cromatográfica de filtración en gel con una fase estacionaria que tiene un intervalo de separación de 20.000 a 40.000 Da, y la elución con un tampón que tiene un pH entre 6 y 9;
- e) identificación y recolección de las fracciones que contienen la manganeso superóxido dismutasa humana modificada;
- f) carga de las fracciones sobre una columna cromatográfica de inmunoafinidad con un anticuerpo anti-hMnSOD unido a la fase estacionaria y la elución de la hMnSOD segregada con una disolución salina capaz de romper la interacción entre el anticuerpo sobre la fase estacionaria y la hMnSOD unida en un tampón con un pH entre 6 y 9.
3. Un procedimiento según la reivindicación 2 que comprende adicionalmente la desalación y concentración.
4. Un procedimiento según las reivindicaciones 2 y 3, en el que en la etapa a) el medio se concentra de 10 a 100 veces.
5. Un procedimiento según las reivindicaciones 2-4, en el que en la etapa b) dicho intercambiador aniónico sobre la fase estacionaria tiene un grupo amino cuaternario como grupo funcional.
6. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha fase estacionaria es Q-Sepharose.
7. Un procedimiento según las reivindicaciones 2 a 6 en el que en la etapa b) dicho gradiente salino lineal es un gradiente lineal de cloruro sódico entre 0,1 M y 1 M.
8. Un procedimiento según las reivindicaciones 2-7, en el que en la etapa d) la fase estacionaria tiene un intervalo de separación entre 3 x 103 y 7 x 104 Da.
9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha fase estacionaria es Superdex 75.
10. Un procedimiento según las reivindicaciones 2-9, en el que en la etapa f) la fase estacionaria es Proteína-G-Sepharose o Sepharose preactivada con CnBr.
11. Un procedimiento según las reivindicaciones 2 a 14, en el que en la etapa f) el anticuerpo unido a la fase estacionaria es un anticuerpo policlonal.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que en la etapa g) la elución se lleva a cabo con NaCl 0,5 M.
13. Un procedimiento según las reivindicaciones 2 a 12, en el que en las etapas a), b), d) y g) dicho tampón tiene un pH comprendido entre 7,4 y 8.
14. Un procedimiento según las reivindicaciones 2 a 13, en el que en las etapas c), y e) la identificación de las fracciones que contienen la manganeso superóxido dismutasa humana se lleva a cabo mediante ensayos inmunológicos, biológicos o enzimáticos.
15. Un procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicho ensayo inmunológico se lleva a cabo mediante transferencia de Western.
16. El procedimiento según la reivindicación 15, en el que dicha prueba biológica consiste en la puesta a prueba de las fracciones obtenidas para la actividad citotóxica sobre células tumorales, en la que dicha actividad indica la presencia de una superóxido dismutasa humana.
17. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicha línea celular es la línea celular MCF-7 de adenocarcinoma.
18. Un procedimiento según la reivindicación 14, en el que dicho ensayo enzimático consiste en la puesta a prueba de las fracciones obtenidas por su capacidad para inhibir la reducción de la sal de Nitro-blue de tetrazolio.
19. Un procedimiento para la preparación de un medicamento para la curación de lesiones cutáneas que comprende la preparación de una manganeso dismutasa humana segregada (hMnSOD) según las reivindicaciones 1-18.
20. Un procedimiento según la reivindicación 19, en el que dichas lesiones cutáneas son úlceras por decúbito, úlceras tórpidas y quemaduras.
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