Polipéptidos con actividad de lipasa/aciltransferasa, con una secuencia de aminoácidos,

que tiene una identidad de, al menos, el 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID No. 2

Lipasa/aciltransferasa a partir de Candida parapsilosis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos con actividad de lipasa/aciltransferasa, a secuencias de aminoácidos de polipéptidos, que muestran esta actividad, a ácidos nucleicos (genes), que codifican estos polipéptidos, a vectores, que contienen aquellos ácidos nucleicos, que codifican estos polipéptidos, a microorganismos transformados, que contienen estos ácidos nucleicos, a procedimientos para llevar a cabo la obtención de estos polipéptidos así como al empleo de ácidos nucleicos para encontrar nuevas lipasas/aciltransferasas y al empleo de estas lipasas/aciltransferasas como catalizadores en procedimientos químicos y bioquímicos.

Estado de la técnica

Con ocasión de la esterificación, según los métodos usuales de la síntesis química, puede producirse, por un lado, la formación de mezclas constituidas por productos monosubstituidos y polisubstituidos, como consecuencia de la presencia de varios grupos hidroxilo libres en el componente alcohólico o en un éster parcial del mismo de tal manera, que se requiere la introducción y la eliminación de grupos protectores cuando quiere llevarse a cabo la síntesis específica de un compuesto determinado.

Con ayuda del empleo de derivados activados de ácidos carboxílicos se forman productos acompañantes y, con frecuencia, también productos secundarios no deseados, que dificultan la elaboración, reducen los rendimientos en producto deseado y constituyen una carga para el medio ambiente. Estos inconvenientes pueden evitarse o, al menos, pueden reducirse si se lleva a cabo la obtención por vía enzimática (por ejemplo de conformidad con el procedimiento que ha sido descrito en la solicitud alemana DE 197 53 789.8).

Los enzimas son empleados, cada vez en mayor medida, en las síntesis químicas y bioquímicas, a título de catalizadores. De este modo, son empleadas ya las hidrolasas en procedimientos a escala industrial, especialmente las lipasas (EC 3.1.1.3) en muchos casos, como consecuencia de que las condiciones de la reacción son frecuentemente suaves, para llevar a cabo la disociación de grasas.

Los procedimientos enzimáticos adecuados para llevar a cabo la esterificación o la transesterificación están descritos, por ejemplo, en la publicación de los autores K. Drauz y H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, VCH-Verlag, Weinheim 1975.

Se sabe que la transesterificación es catalizada en medios anhidros por medio de lipasas. Cuando en el sistema de reacción de ésteres, alcohol y lipasas esté presente también el agua, se produce normalmente una disociación de los ácidos grasos enlazados para dar ácidos grasos libres. Puesto que diversas lipasas catalizan también la formación de ésteres a partir de ácidos grasos libres y de alcoholes, se lleva a cabo como efecto final una reacción de transesterificación con un producto intermedio ácido. Desde luego, para muchos procesos industriales constituye un gran inconveniente la formación de ácidos libres en el sistema. El contenido en agua impide parcialmente una reacción industrial y comercialmente aceptable (formación de un equilibrio termodinámico desfavorable). Para conseguir rendimientos satisfactorios tienen que ser empleadas costosas instalaciones industriales (eliminación del agua por ejemplo por medio de una destilación azeotrópica, procedimientos de separación por medio de membranas, destilación en vacío).

En la literatura ha sido descrito ya un polipéptido, que es único en su género hasta el presente, que presenta actividad de lipasa/aciltransferasa. Este polipéptido fue aislado a partir del microorganismo Candida parapsilosis CBS 604. Sin embargo, hasta el presente sólo se ha llevado a cabo la evaluación, exclusivamente, de la capacidad de reacción de este polipéptido. Es posible con el polipéptido procedente del microorganismo Candida parapsilosis, que presenta tanto propiedades de lipasa así como también propiedades de aciltransferasa, mantener en un nivel muy bajo los productos intermedios de un ácido (graso) libre incluso en presencia de agua (con una actividad > 0,8). Al mismo tiempo puede mantenerse controlado el coste industrial. (Véase la publicación de los autores L. Vaysse, E. Dubreucq, J.-L. Pirat, P. Galzy; J. Biotech. 53 (1997) 41-46).

El inconveniente de las reacciones catalizadas por vía enzimática reside frecuentemente en la disponibilidad y en la estabilidad de los polipéptidos.

Descripción de la invención

La tarea de la presente solicitud de patente consistía en caracterizar y en proporcionar aquellos polipéptidos, que posibiliten una transferencia de grupos acilo con elevados rendimientos incluso en un medio acuoso y que, por lo tanto, venzan los inconvenientes tradicionales que se presentan en el caso de una esterificación catalizada por medio de lipasas.

Por lo tanto, la tarea de la presente solicitud de patente consistía en aislar estos polipéptidos, en descifrar la secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos, que codifica esta secuencia de aminoácidos, puesto que éstas son imprescindibles tanto para la obtención por bioingeniería así como también para el desarrollo ulterior del polipéptido.

Otra tarea parcial consistía en posibilitar la producción por bioingeniería de las lipasas/aciltransferasas encontradas y de este modo proporcionar rendimientos elevados y conseguir entonces la posibilidad de encontrar organismos alternativos por medio de una selección de las homologías de secuencia. Por lo tanto, estaba incluido en esta tarea el hecho de proporcionar células huésped transformadas, que fuesen capaces de producir este polipéptido.

En el sentido de la presente solicitud, se entiende por polipéptido aquel polímero compuesto por aminoácidos naturales, estructurado de forma ampliamente lineal, que adquiere, en la mayoría de los casos, una estructura tridimensional para ejercer su función. En la presente solicitud están denominados los 19 L-aminoácidos proteinógenos, que se encuentran en la naturaleza, con el código internacional usual formado por 1 y 3 letras. Otra denominación también es la de proteína, debiéndose dar una limitación del número de unidades monómeras en el polipéptido de 50 como mínimo.

En el sentido de la invención se entiende por "actividad de lipasa/aciltransferasa" la actividad de un polipéptido o de un enzima, que reúne las propiedades de las lipasas con las propiedades de las aciltransferasas. Las lipasas (EC 3.1.1.3) pertenecen al grupo de las hidrolasas (especial de las esterasas), que disocian de forma específica a las grasas (triglicéridos) en glicerina y en ácidos grasos; este proceso, que se denomina lipólisis, se produce en la interfase comprendida entre la grasa y el agua. Una propiedad importante, que conduce a la inclusión en el grupo de las hidrolasas, consiste en la actividad tensioactiva de las lipasas. Juega un papel en la catálisis una triada catalítica constituida por la serina, la histidina y el ácido asparagínico (o ácido glutamínico). Las aciltransferasas (EC 2.3) se denominan también transacilasas y pertenecen al grupo de las transferasas. Éstas transfieren de una manera muy general grupos acilo o, de manera especial, grupos acetilo desde una molécula donante hasta una molécula aceptora y, por lo tanto, son especialmente importantes para la formación y para la degradación de grasas. Se ha observado por medio de estudios realizados con las lipasas/aciltransferasas de conformidad con la invención, que este polipéptido es tensioactivo y que cataliza aquellas reacciones, que son características de la lipasas. Así mismo se ha encontrado que este polipéptido es capaz de catalizar transesterificaciones con un contenido en agua en la mezcla de la reacción, que corresponde a una actividad en agua mayor que 0,8. Con este contenido en agua, una lipasa tradicional catalizaría únicamente la hidrólisis del éster. Por lo tanto, se trata de un polipéptido que presenta rasgos caracterizantes tanto de las lipasas así como, también, de las aciltransferasas. El polipéptido de origen natural, de conformidad con la invención, está constituido por una lipasa, como consecuencia de homologías de secuencia con respecto a los enzimas conocidos hasta ahora tales como, por ejemplo, las lipasas procedentes de Candida albicans y están constituidos por una aciltransferasa como consecuencia de su actividad enzimática.

Como donantes preferentes en el sentido de la invención para las reacciones catalíticas con la lipasa/aciltransferasa,...

1. Polipéptidos con actividad de lipasa/aciltransferasa, con una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de, al menos, el 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID No. 2.

2. Polipéptidos con actividad de lipasa/aciltransferasa, con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en las posiciones 190 hasta 390 al menos en un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2.

3. Polipéptidos con actividad de lipasa/aciltransferasa, con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en las posiciones 190 hasta 390 al menos en un 96% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2.

4. Polipéptidos con actividad de lipasa/aciltransferasa, con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2.

5. Polipéptidos según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizados porque se presentan en estado glicosilado.

6. Polipéptidos según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizados porque están enlazados con otro péptido.

7. Polipéptidos según la reivindicación 6, caracterizados porque el otro péptido está constituido por un marcador, preferentemente está constituido por his-tag.

8. Polipéptidos con una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad del 80% como mínimo con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 4.

9. Polipéptidos con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en un 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 4.

10. Fragmento polipéptido o polipéptidos, que pueden ser obtenidos por medio de una mutación por deleción, con actividad de lipasa/aciltransferasa, según una de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Polipéptidos con actividad de lipasa/aciltransferasa según las reivindicaciones 1 a 10, cuya cadena pura de aminoácidos ha sido químicamente modificada.

12. Polipéptidos según al menos una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizados porque pueden ser obtenidos de forma natural a partir de un microorganismo.

13. Polipéptidos según la reivindicación 12, caracterizados porque el microorganismo está constituido por un hongo eucariota, de manera preferente está constituido por hongos de levadura.

14. Polipéptidos según la reivindicación 12, caracterizados porque pueden ser obtenidos a partir de microorganismos, elegidos entre el grupo que está formado por Candida parapsilosis, Candida antarctica (Trychosporon oryzae, Pseudozyma antarctica), Candida glabrata, Candida albicans, Candida maltosa, Candida tropicalis, Candida viswanathii, Issatchenkia orientalis (Candida krusei), Kluyveromyces marxianus (C. kefyr, C. pseudotropicalis), Pichia guilliemondii (Candida guilliermondii), Geotrichum candidum, Fusarium solani y Aeromonas aerophila.

15. Ácidos nucleicos, que codifican un polipéptido con actividad de lipasa/aciltransferasa, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica en un 100% con respecto a la secuencia de nucleótidos que está indicada en la SEQ ID No. 1, especialmente a través de la región parcial, que corresponde a los aminoácidos 190 hasta 390 de conformidad con la SEQ ID No. 2.

16. Ácidos nucleicos, que codifican una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de, al menos, un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2, representando la secuencia de aminoácidos un polipéptido con actividad de lipasa/aciltransferasa.

17. Ácidos nucleicos, que codifican una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en las posiciones 190 hasta 390 al menos en un 96% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2, representando la secuencia de aminoácidos un polipéptido con actividad de lipasa/aciltransferasa.

18. Ácidos nucleicos, que codifican uno de los polipéptidos o derivados que han sido indicados en las reivindicaciones 1 a 14.

19. Ácidos nucleicos, que codifican un polipéptido con actividad de lipasa/aciltransferasa, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de nucleótidos que está indicada en la SEQ ID No. 3.

20. Ácidos nucleicos, que codifican una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de un 80% como mínimo con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 4, representando la secuencia de aminoácidos un polipéptido con actividad de lipasa/aciltransferasa.

21. Vector, que contiene uno de los ácidos nucleicos indicados en las reivindicaciones 15 a 20, que codifica uno de los polipéptidos o derivados que han sido indicados en las reivindicaciones 1 a 14.

22. Vector de clonación según la reivindicación 21.

23. Vector de expresión según la reivindicación 21.

24. Célula, que contiene un vector según una de las reivindicaciones 21 a 23.

25. Célula huésped transformada, que expresa uno de los polipéptidos o derivados que han sido indicados en las reivindicaciones 1 a 14 o que puede ser inducida para llevar a cabo su expresión, por medio del empleo de un vector de expresión según la reivindicación 23.

26. Célula huésped transformada según la reivindicación 25, que contiene un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad del 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2.

27. Célula huésped transformada según la reivindicación 25 y/o 26, que contiene un ácido nucleico, que codifica una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de un 80% como mínimo con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2.

28. Célula huésped transformada según la reivindicación 25, que contiene un ácido nucleico, que codifica una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad del 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 4.

29. Célula huésped transformada según la reivindicación 25 y/o 26, que contiene un ácido nucleico, que codifica una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de un 80% como mínimo con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 4.

30. Células huésped transformadas según una de las reivindicaciones 25 a 29, caracterizadas porque las células huésped, que deben ser transformadas, están constituidas por células huésped procedentes de microorganismos.

31. Células huésped transformadas según una de las reivindicaciones 25 a 30, caracterizadas porque las células huésped, que deben ser transformadas, están constituidas por células huésped procedentes de microorganismos, que se eligen entre el grupo que está formado por Candida parapsilosis, Saccharamyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia boidinii, Pichia stipitis, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Schwanniomyces castellii, Yarrowia lipolytica, Escherishia coli, Bacillus subtilis, Bacillus amylolichefaciens, Bacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis, Lactococcus lactis, Streptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Aspergillus orizae, Aspergillus niger, Trichoderma reesei, Mucor sp. y Rhizopus sp.

32. Procedimiento para la obtención de un polipéptido según, al menos, una de las reivindicaciones 1 a 14, por medio del empleo de un ácido nucleico, que codifica una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de un 80% como mínimo con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2 y/o por medio del empleo de un vector según una de las reivindicaciones 21 a 23 y/o por medio del empleo de una célula huésped transformada según una de las reivindicaciones 25 a 31 o con empleo de una célula, que lo forma de manera natural.

33. Empleo de microorganismos naturales y/o recombinantes, que contienen un ácido nucleico para la obtención de un polipéptido según, al menos, una de las reivindicaciones 1 a 14.

34. Empleo de un ácido nucleico según las reivindicaciones 15 a 20 y/o empleo de secuencias de aminoácidos, que tienen una identidad de un 80% como mínimo con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2, para llevar a cabo el descubrimiento de nuevas aciltransferasas.

35. Empleo de un ácido nucleico según las reivindicaciones 15 a 20 y/o empleo de secuencias de aminoácidos, que tienen una identidad de un 80% como mínimo con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 4, para llevar a cabo el descubrimiento de nuevas aciltransferasas.

36. Empleo de polipéptidos según la reivindicación 1 a 14 como catalizadores en las reacciones de transferencia de grupos acilo, de manera especial en las reacciones que están elegidas entre el grupo formado por la alcoholisis de los ésteres, la alcoholisis de los tioésteres, la tiolisis de los ésteres, la aminolisis de un éster con hidroxilaminas o con hidrazinas; la reacción de un éster con peróxidos de hidrógeno y la síntesis enantioselectiva de ésteres, de tioésteres, de lactonas por medio de una alcoholisis.