Procedimiento para la isomerización microbiológica de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos de la fórmula I,

Procedimiento para la isomerización microbiológica de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos.

La presente invención comprende un procedimiento para la isomerización microbiológica de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos acorde a las reivindicaciones.

Estado actual de la técnica

Por el estado actual de la técnica se conocen las denominadas mandelato racemasas microbianas, que tanto in vitro como in vivo son capaces de racemizar el ácido amigdálico (G.l. Kenyon, J.A. Gerlt, G.A. Petsko y J.W. Kozarich, "Mandelate Racemase: Structure-Function Studies of a Pseudosymmetric Enzyme" (Mandelato racemasa: estudios de la función estructural de una enzima pseudosimétrica), Accts. Chem. Res., 28, 178-186 (1995); R. Li, V.M. Powers, J.W. Kozarich y G.l. Kenyon, "Racemization of Vinylglycolate Catalyzed by Mandelate Racemase" (Racemización de glicolatos de vinilo catalizados por mandelato racemasas), J. Org. Chem., 60, 3347-3351 (1995); S.S. Schafer, A.T. Kallarakal, J.W. Kozarich, J.A. Gerlt, J.R. Clifton y G.l. Kenyon, "Mechanism of the Reaction Catalyzed by Mandelate Racemase: The Structure and Mechanistic Properties of the D270N Mutant" (El mecanismo de la reacción catalizada por mandelato racemasa: la estructura y mecánica del mutante D270N), Biochemistry, 35, 5662-5669 (1996); B. Schnell et al., "Enzymatic Racemisation and its Application to Synthetic Biotranformations" (Racemización enzimática y su aplicación para las biotransformaciones sintéticas), Adv. Synth. Catal. 345, 653-666 (2003);U.T. Strauss and K. Faber, "Deracemization of (6) mandelic acid using a lipase-mandelate racemase two-enzyme system" (Desracemización de (6) ácido amigdálico utilizando un sistema de dos enzimas de lipasa-mandelato racemasa), Tetrahedron: Assymetry 10:4079-4081 (1999)).

El metabolismo de lactatos de bacterias de ácido láctico está descrito en S.-Q Liu, "Practical implications of lactat and pyruvate metabolism by lactic acid bacteria in food and beverage fermentations" (Implicancias prácticas del metabolismo de lactato y piruvato mediante bacterias ácido lácticas en fermentaciones de alimentos y bebidas), Int. J. Food Microbiol. 83, 115-131 (2003).

El póster-abstract publicado posteriormente, de S.M. Gluck et al., "Lactate Racemase as a versatile tool for the racemazation of a-hydroxycarbolic acids" (Lactato racemasa como herramienta versátil de ácidos a-hidroxicarboxílicos), Chemicke Listy 97, 363, P121 (2003) menciona la aplicación de lactato racemasas para la racemización de ácidos alfa-hidroxi.

Al mismo tiempo, existe una gran demanda de fabricación simple de sustancias quirales, no racémicas, por ejemplo, para la producción de sustancias activas en la industria farmacéutica. La racemización de catalización enzimática de una forma estereoisómera de un compuesto obteniendo el enantiómero deseado representaría un camino adecuado para la obtención del material quiral no racémico deseado. Las racemasas conocidas, sin embargo, se caracterizan por su elevada especificidad de sustrato. Por ello, la mandelato racemasa sólo es adecuada para la racemización biocatalítica de ácidos alfa-hidroxi beta,gamma-insaturados. No se aceptan ácidos alfa-hidroxicarboxílicos saturados (véase Felfer, U. et al., J. Mol. Catal. B: Enzymatic 15, 213 (2001)).

Breve descripción de la invención

El objeto de la presente invención es presentar microorganismos y preparados enzimáticos que presenten una actividad racémica novedosa, así como la presentación de procedimientos para la racemización de compuestos químicos estereoisómeros utilizando dichas enzimas o microorganismos.

Sorprendentemente, el objeto se alcanzó presentando un procedimiento para la isomerización microbiológica de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos acorde a la reivindicación 1.

Un primer objeto de la invención comprende un procedimiento para la isomerización microbiológica de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos de la fórmula I

en la cual

R representa un alquilo C₂-C₈ o alquenilo C₂-C₈ o -(CH₂)_n-Cyc, de cadena lineal o de cadena ramificada, preferentemente, un alquilo C₂-C_8, en el cual n representa un valor entero de 0 a 4, preferentemente, 1, 2 o 3, y Cyc es un anillo carbo o heterocíclico, de uno o dos núcleos, eventualmente, mono o polisustituido, por ejemplo, un anillo aromático preferentemente heteroaromático eventualmente sustituido, preferentemente, un anillo mononuclear aromático eventualmente sustituido,

en el cual se isomeriza un sustrato que contiene, esencialmente, una primera forma estereoisómera de un ácido alfa-hidroxicarboxílico de la fórmula (I) y eventualmente, se aísla la mezcla isómera obtenida o un segundo estereoisómero obtenido aislado, o se extrae del equilibrio de reacción un segundo estereoisómero.

Preferentemente, la isomerización enzimática se realiza mediante la conversión del sustrato con un extracto celular que contiene enzimas (por ejemplo, un extracto crudo tras la disolución celular y eliminación de fragmentos celulares) o en presencia de células enteras de un microorganismo definido en la reivindicación 1.

Los microorganismos especialmente adecuados son las bacterias de la especie de lactobacillus y lactococcus.

Acorde a una variante preferida, la conversión se realiza en presencia de células enteras de microorganismos de la especie de lactobacillus, o células enteras de un microorganismo recombinante que expresan una actividad enzimática definida anteriormente.

Los microorganismos preferidos están seleccionados entre l. paracasei, l. delbrueckii, l. sakei y l. oris, especialmente, entre las cepas l. paracasei DSM 20207 y DSM 2649, l. delbrueckii DSM20074, l. sakei DSM 20017 y l. oris DSM 4864.

Una actividad enzimática útil acorde a la invención comprende, por ejemplo, la racemización de, al menos, un compuesto seleccionado entre la forma (R) y/o la forma (S) de fenillactato, 4-fluorfenillactato, ácido 2-hidroxi-4-fenilbutírico, ácido 2-hidroxi-4-metilpentancarboxílico y 2-hidroxi-3-metilbutírico.

En un modo de ejecución preferido del procedimiento anterior, se extrae en gran parte el estereoisómero deseado de la mezcla isómera obtenida, preferentemente, tras aislar la mezcla del medio reactivo, por ejemplo, por cromatografía, reacción siguiente estereoselectiva química o enzimática y, eventualmente, otra separación del producto secuencial y el residuo que contiene, esencialmente, el estereoisómero no deseado, es sometido nuevamente a una isomerización.

Esto puede repetirse la cantidad de veces que sea deseado, hasta alcanzar una conversión completa, obteniendo el estereoisómero deseado o su producto secuencial.

En otra variante preferida del procedimiento, la mezcla isómera obtenida, preferentemente, tras el aislamiento de la mezcla del medio reactivo, por ejemplo, por cromatografía, se somete a una reacción siguiente química o enzimática estereoselectiva y la mezcla de reacción resultante que también contiene el isómero no convertido del ácido hidroxicarboxílico se somete nuevamente a una isomerización acorde a la invención. Esto puede repetirse la cantidad de veces que sea deseado, hasta alcanzar una conversión completa, obteniendo el estereoisómero deseado o su producto secuencial.

En otra variante preferida del procedimiento, la reacción de isomerización se acopla a una reacción siguiente enantioselectiva química o enzimática, preferentemente, en una denominada reacción en un solo tubo, asimismo, el estereoisómero deseado obtenido del ácido alfa-hidroxicarboxílico es extraído del equilibrio de reacción paso a paso o de manera continua.

Las reacciones siguientes enantioselectivas preferidas, químicas o enzimáticas, del paso de isomerización acorde a la invención, están seleccionadas entre una esterificación y una amidación de una forma estereoisómera del ácido alfa-hidroxicarboxílico. La reacción siguiente enantioselectiva puede realizarse, especialmente, en un grupo carboxilo o hidroxilo.

El procedimiento acorde a la invención también sirve como procedimiento de análisis de microorganismos que expresan la actividad enzimática definida anteriormente, en el que un microorganismo en el cual se sospecha dicha...

1. Procedimiento para la isomerización microbiológica de ácidos alfa-hidroxicarboxílicos de la fórmula I,

en la cual

R representa un alquilo C₂-C₈ o alquenilo C₂-C₈ o -(CH₂)_n-Cyc, de cadena lineal o de cadena ramificada, en la cual n representa un valor entero de 0 a 4 y Cyc es un anillo carbo o heterocíclico, de uno o dos núcleos, eventualmente, mono o polisustituido, en el cual se isomeriza un sustrato que contiene, esencialmente, una primera forma estereoisómera de un ácido alfa-hidroxicarboxílico de la fórmula (I), mediante un extracto enzimático de un microorganismo o en presencia de células enteras de un microorganismo, asimismo, el microorganismo está seleccionado entre microorganismos naturales o recombinantes de la especie de lactobacillus o lactococcus para la racemización, aptos para la racemización de, al menos, un compuesto seleccionado entre la forma (R) y/o la forma (S) de fenillactato, 4-fluorfenillactato, ácido 2-hidroxi-4-fenilbutírico, ácido 2-hidroxi-4-metilpentancarboxílico y 2-hidroxi-3-metilbutírico, y, eventualmente, se aísla del equilibrio de reacción la mezcla isómera obtenida o un segundo estereoisómero obtenido aislado, o se extrae del equilibrio de reacción un segundo estereoisómero.

2. Procedimiento acorde a la reivindicación 1, en el cual el microorganismo está seleccionado entre l. paracasei, l. delbrueckii, l. sakei y l. oris.

3. Procedimiento acorde a la reivindicación 2, en el cual el microorganismo está seleccionado entre l. paracasei DSM 20207 (DSM 15755) y DSM 2649 (DSM 15751), l. delbrueckii DSM20074 (DSM 15754), l. sakei DSM 20017 (DSM 15753 y l. oris DSM 4864 (DSM 15752).

4. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual, a partir de la mezcla resultante de isomerización se extrae en gran parte el estereoisómero deseado y el residuo es sometido nuevamente a una isomerización.

5. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual la mezcla isómera obtenida se somete a una reacción siguiente estereoselectiva química o enzimática y la mezcla de reacción obtenida es sometida nuevamente a una isomerización.

6. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual la reacción de mezcla isómera se acopla a una reacción subsiguiente enantioselectiva, química o enzimática, en donde el estereoisómero deseado obtenido del ácido alfa-hidroxicarboxílico es extraído del equilibrio de reacción.

7. Procedimiento acorde a una de las reivindicaciones 5 y 6, en el cual la reacción subsiguiente enantioselectiva química o enzimática está seleccionada entre una esterificación y una amidación del ácido alfa-hidroxicarboxílico.