PROCEDIMIENTO PARA LA IDENTIFICACION DE COMPUESTOS PARA LA TERAPIA DE PROCESOS DE ENVEJECIMIENTO DEL SISTEMA CARDIOVASCULAR.

Procedimiento in vitro para la identificación de un compuesto capaz de modificar la actividad del receptor de urotensina II de tal manera que influye sobre la actividad o cantidad de un gen o producto génico que interviene en la composición,

formación o degradación de la matriz extracelular, en donde a] se proporciona una célula en la que se forma el receptor de urotensina II, b] se proporciona un compuesto químico, c] se hace contactar la célula de a] con el compuesto químico de b], d] a continuación, se determina la actividad o cantidad de un gen o de su producto génico a partir de las células de c], en donde este gen o producto génico interviene en la composición, formación o degradación de la matriz extracelular, e] se compara la actividad o cantidad obtenidas en d] con la actividad o cantidad del mismo gen o producto génico a partir de una célula de control correspondiente, que no ha sido puesta en contacto con el compuesto del apartado b], en donde, en el apartado d] se selecciona al menos un gen del grupo consistente en Col 1, MMP2, TGF-beta 1 o CTGF

La invención se refiere a un procedimiento in vitro para la identificación de un compuesto que modifica la actividad del receptor de urotensina II, influyendo de este modo sobre los procesos de envejecimiento del sistema cardiovascular.

La urotensina II (UII) es un péptido que actúa sobre los vasos sanguíneos. Dependiendo del tipo de vaso y de la especie, genera efectos vasodilatadores y vasoconstrictores. La actividad es comparable, en numerosos aspectos, a la de la angiotensina II (All). Tanto la urotensina II como su receptor, GPR14, se encuentran presentes en el sistema cardiovascular humano, por ejemplo, en las células endoteliales, las células musculares lisas de las arterias coronarias, en el miocardio o en el ateroma coronario. Por lo tanto, se atribuye a ambos factores una función importante en la organización cardiovascular a nivel celular y, por consiguiente, en los procesos fisiopatológicos. La urotensina II es conocida como ligando natural de GPR14. GPR14 pertenece al grupo de los GPCR (receptores acoplados a la proteína G).

Experimentos llevados a cabo con urotensina II sobre monos anestesiados condujeron a modificaciones llamativas de los parámetros hemodinámicos. El aumento de la resistencia periférica, junto con un debilitamiento de la contractilidad cardiaca y una reducción del volumen sistólico llevaron al colapso del sistema cardiovascular. También en el ser humano tienen lugar procesos comparables.

Los receptores acoplados a la proteína G (GPCR, por sus siglas en inglés) juegan un papel fundamental en una pluralidad de procesos fisiológicos muy diversos. Se supone que en el genoma humano aproximadamente 1000 genes codifican esta familia de receptores. Se estima que entre 40 y 50% de los medicamentos disponibles actualmente bajo prescripción médica actúan como agonistas o antagonistas de los GPCR. Esto pone de manifiesto el importante papel que juega esta clase de receptores en la industria farmacéutica. En virtud del tamaño e importancia de la familia de proteínas y considerando el hecho de que para numerosos GPCR no se conocen todavía ligandos fisiológicos (GPCR huérfanos), se debe aceptar que esta clase de receptores será en el futuro una de las principales reservas de proteínas diana apropiadas en la investigación de nuevos medicamentos.

Los GPCR constituyen una familia de proteínas integrales de membrana, que se localizan en la superficie celular. Reciben señales extracelulares (por ejemplo, hormonas, neurotransmisores, péptidos, lípidos), y transmiten estas señales a través de una familia de proteínas que se unen al nucleótido guanina, las llamadas proteínas G, hacia el interior de la célula. De esta forma, activan diferentes vías de transducción de señales, en función de la especificidad del receptor, de la proteína G activada y del tipo de célula. Las cadenas de polipéptidos de todos los GPCR están formadas por siete hélices α que se extienden a lo largo de la doble capa fosfolipídica de la membrana celular. En base a los siete canales que atraviesan la membrana, se producen bucles extra e intracelulares que hacen posible la fijación extracelular de ligandos y el acoplamiento intracelular de proteínas G. Por esta razón, los GPCR reciben también el nombre de receptores transmembrana de 7 dominios.

Todos los receptores acoplados a la proteína G funcionan según un modelo básico común: La unión de un ligando extracelular lleva a una modificación de la conformación de la proteína del receptor, de modo que puede entrar en contacto con una proteína G. A través de las cascadas de transducción de señales, mediadas por la proteína G en el interior de la célula, se produce en último término una respuesta biológica de las células.

Las proteínas G son proteínas heterotrímeras, que constan de subunidades α, β y γ, y que se encuentran localizadas en la cara interior de la membrana celular mediante anclajes lipídicos. El acoplamiento de GPCR activados determina un intercambio GDP/GTP de la subunidad Gα, así como la disociación del heterotrímero en una subunidad α y una subunidad βγ. Tanto la subunidad alfa activada como el complejo beta-gamma pueden influir sobre las proteínas efectoras intracelulares.

La activación de la adenilciclasa (AC) presente en la membrana por medio de las proteínas G del tipo Gαs da lugar, por ejemplo, al incremento del nivel intracelular de AMPc o a su reducción por la activación de proteínas G del tipo Gαi. Las proteínas G del tipo Gq activan la fosfolipasa C (PLC), que cataliza la formación de inositol-1,4,5trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). Por su parte, estas moléculas conducen a la liberación de Ca2+ desde los depósitos intracelulares, o a la activación de la proteinquinasa C (PKC) que, en ambos casos, tienen efectos adicionales. Además de los tipos de proteínas G (Gαi/s, Gq) citados anteriormente, existen otros tipos adicionales, que se designan como G16, G12/13 etc. La pluralidad de estas proteínas G refleja la pluralidad de muy diversas funciones de los GPCR.

En la Solicitud Internacional WO 01/14888 se describe un procedimiento que sirve para identificar agonistas y antagonistas del receptor de urotensina II. Este procedimiento utiliza una señal de la cascada de transducción de señales influida por el receptor modificado para determinar el estado del receptor en relación con su interacción con un agonista o antagonista.

En la publicación de Douglas et al. en TCM Vol. 10, No. 6, 2000 se describe que el receptor de urotensina II humano aumenta la expresión de ARNm procolágeno α1-(1). De aquí se deduce que existe la posibilidad, como sucede con otros espasmogénicos (por ejemplo, ET-1, angiotensina-II, norepinefrina, entre otros), de que el receptor genere fibrosis en los vasos sanguíneos del corazón y en los vasos periféricos.

En la publicación de Chen et al. en J. Mol. Cell. Cardiol. 32, 1802-1819 (2000) se señala que el TGF-β es un regulador específico de CTGF tanto en los miocitos como en los fibroblastos del corazón. En este caso, la inducción de CTGF a través del TFG-β se correlaciona con un incremento significativo de fibronectina, colágeno y PAI1 en los fibroblastos cardiacos.

Fitzgerald et al. indican en Atherosclerosis 145, 97-106 (1999) que, en el conejo, la excitación de sus carótidas por ensayos de balonamiento induce simultáneamente la producción de heparanasa y MMP2 activo, y que en pacientes en el estadio final de lesiones ateroscleróticas complejas, se observa una actividad simultánea de la heparanasa, MMP2 y MMP9.

En el documento WO 00/75168 se da a conocer el receptor de urotensina II del ratón. Así mismo, se conocen métodos para la identificación de agonistas y antagonistas de GPR14, por ejemplo en el documento WO 99/40192.

Hasta la fecha, en el estado de la técnica en relación con métodos de análisis, no se ha encontrado ninguna referencia especial al uso del receptor de urotensina II para la detección de compuestos tales como genes o productos génicos que intervienen en la generación, composición o degradación de la matriz extracelular. Por este motivo, no es posible investigar, desde el punto de vista farmacéutico, sustancias que actúen de forma suficientemente eficaz contra enfermedades que cursan con un incremento del tejido conjuntivo.

Por lo tanto, la invención se refiere a un procedimiento in vitro para identificar un compuesto capaz de modificar la actividad del receptor de urotensina II de tal manera que sea posible influir sobre la actividad o la cantidad de un gen o producto génico que interviene en la composición, formación o degradación de la matriz extracelular, en donde a] se utiliza una célula en la que se forma el receptor de urotensina II, b] se utiliza un compuesto químico, c] se hace contactar la célula de a] con el compuesto químico de b], d] a continuación, se determina la actividad o cantidad de un gen o de su producto

génico a partir de las células de c], en donde este gen o producto génico interviene

en la composición, formación o degradación de la matriz extracelular, e] se compara la actividad o cantidad obtenidas en d] con la actividad o cantidad del

mismo gen o producto génico a partir de una célula de control correspondiente,

que no ha sido puesta en contacto con el compuesto del apartado b],

en donde, en el apartado d], se selecciona al menos un gen del grupo consistente

en Col1,...

1. Procedimiento in vitro para la identificación de un compuesto capaz de modificar la actividad del receptor de urotensina II de tal manera que influye sobre la actividad o cantidad de un gen o producto génico que interviene en la composición, formación o degradación de la matriz extracelular, en donde a] se proporciona una célula en la que se forma el receptor de urotensina II, b] se proporciona un compuesto químico, c] se hace contactar la célula de a] con el compuesto químico de b], d] a continuación, se determina la actividad o cantidad de un gen o de su producto

génico a partir de las células de c], en donde este gen o producto génico interviene en la composición, formación o degradación de la matriz extracelular,

e] se compara la actividad o cantidad obtenidas en d] con la actividad o cantidad del mismo gen o producto génico a partir de una célula de control correspondiente, que no ha sido puesta en contacto con el compuesto del apartado b],

en donde, en el apartado d] se selecciona al menos un gen del grupo consistente en Col 1, MMP2, TGF-beta 1 o CTGF.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la célula utilizada es una célula de mamífero.

3 Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la célula utilizada es una célula humana.

4. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula utilizada es una célula cardiaca o un fibroblasto.

5. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el compuesto utilizado tiene un peso molecular entre 100 y 50.000 kDa.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el peso molecular se encuentra entre 100 y 5.000 kDa.

7. Procedimiento según la reivindicación 5 ó 6, en el que el compuesto es una sustancia natural, una proteína, un polinucleótido, un compuesto que contiene azúcares o un compuesto que contiene lípidos.

5 8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el compuesto es urotensina II.

9. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, en el que

la determinación según los apartados d] o e] se lleva a cabo por medio de una PCR 10 cuantitativa.

10. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la determinación según los apartados d] o e] se lleva a cabo por medio de una reacción enzimática.

11. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la determinación según los apartados d] o e] se lleva a cabo por medio de un anticuerpo.