Procedimientos para la diferenciación rápida entre soja transgénica y no transgénica empleando perfiles proteicos cromatográficos por Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC) en fase inversa empleando columnas monolíticas y de perfusión.

Ambos métodos se basan en un gradiente binario y lineal en dos etapas con acetonitrilo-agua-ácido trifuroacético a un flujo de 3 ml/min y empleando detección UV a 280 nm. Su aplicación conjunta con técnicas de clasificación multivariante, conduce a un mayor aseguramiento de los resultados, en especial cuando el contenido en material transgénico es pequeño

Procedimientos para la diferenciación rápida entre soja transgénica y no transgénica empleando perfiles proteicos cromatográficos.

Los procedimientos analíticos propuestos permiten la diferenciación entre soja transgénica y no transgénica mediante el análisis de los perfiles proteicos obtenidos por Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC) con fases estacionarias monolíticas y perfusivas. Teniendo en cuenta la enorme controversia asociada al consumo de alimentos transgénicos y al hecho de que empieza a haber estudios científicos que demuestran que algunas modificaciones genéticas podrían tener consecuencias nutricionales e incluso toxicológicas, estos procedimientos suponen un gran avance por dos motivos: (i) ofrecen la posibilidad de emplear técnicas cromatográficas de análisis que pueden implementarse fácilmente en análisis de rutina y (ii) permiten el cribado rápido entre soja transgénica y no transgénica basándose en el análisis de perfiles proteicos expresados a partir del ADN original o modificado (transgénico).

Estado de la técnica

El alto consumo y aplicación de la soja se debe a su bajo coste y a sus apreciadas propiedades funcionales y nutritivas, lo que ha resultado en un creciente interés por mejorar su cultivo y características [1,2]. La mejora en la producción de soja también está relacionada con la resistencia a insectos y enfermedades de las plantas. En este sentido, mientras la resistencia genética a la mayoría de las enfermedades que afectan a la soja (hongos, bacterias, virus, nemátodos) ya están disponibles en las colecciones fitogenéticas, la resistencia a los insectos ha sido un objetivo difícil de alcanzar por técnicas convencionales de cultivo. El progreso en la tecnología de ADN recombinante ha permitido la producción de organismos modificados genéticamente (OMG) mediante la introducción en el genoma de la planta de un nuevo gen que expresa una nueva proteína. Con respecto a la soja, un logro importante ha sido el desarrollo de tolerancia al herbicida glifosato [3]. El glifosato es un herbicida que elimina plantas inhibiendo el enzima 5-enolpiruvilsikimato-3-fosfato sintasa (EPSFS) que está involucrado en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos. Algunos microorganismos, como el Agrobacterium tumefaciens strain CP4, tienen una versión de este enzima que es resistente a la inhibición del glifosato. El gen que codifica el enzima CP4-EPSFS de Agrobacterium tumefaciens se ha trasferido a la soja empleando la tecnología genética molecular resultando una soja con tolerancia al glifosato llamada Roundup Ready^TM que se comercializó por primera vez por la empresa Monsanto en 1996 [4]. Así, el uso de soja Roundup Ready^TM permite a los agricultores emplear el herbicida glifosato para eliminar las malas hierbas sin dañar la soja. Hoy en día, la mayoría de los campos de soja en los Estados Unidos están plantados con soja resistente al glifosato, siendo EEUU el mayor productor de soja transgénica seguido de Argentina y Brasil [5].

Sin embargo, el cultivo y comercialización de cultivos transgénicos ha provocado una enorme controversia pública. Los productores defienden que los cultivos transgénicos son, desde un punto de vista económico (mejora la producción) y medioambiental (bajo empleo de agroquímicos), más beneficiosos que los cultivos no transgénicos siendo equivalentes en composición a éstos. Por otro lado, los detractores de los cultivos transgénicos afirman que el consumo de transgénicos conlleva muchos riesgos como la aparición de alergenos producidos por la expresión de proteínas nuevas, la transferencia de resistentes a antibióticos procedentes de los genes marcadores, etc. [6,7]. Además, aunque los productos transgénicos son casi idénticos a los no transgénicos, hay estudios que demuestran que algunas variaciones podrían tener consecuencias nutricionales y toxicológicas [8,9]. Esta controversia ha provocado que algunos países hayan establecido niveles máximos para los productos etiquetados que contienen soja transgénica como Japón (tolerancia del 5%), Corea (3%), Noruega (2%), Suiza (1%) y la Unión Europea (0.9% incluyendo España) mientras que en otros como EEUU no hay limitaciones de modo que los alimentos que contengan OMGs no necesitan un etiquetado especial [11].

Todas estas restricciones demandan el desarrollo de métodos analíticos rápidos y fiables que permitan la detección de OMGs a los niveles establecidos por las normativas de cada país. La mayoría de las metodologías detectan OMGs mediante el examen de secuencias específicas de ADN amplificadas por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esta metodología consiste en diferentes etapas: muestreo, extracción del ADN, purificación, amplificación y detección de las secuencias amplificadas [12]. El proceso es largo, complejo y está sujeto con mucha frecuencia a contaminaciones por ADN lo que da como resultado falsos positivos. Las proteínas son otra diana que podría ser útil para la detección de soja transgénica. La nueva proteína expresada por la inserción de genes ha sido detectada por ensayos de inmunosorbente enlazado con enzima (ELISA) y analizada por espectrometría de masas [13,14].

El propósito de esta invención es poner a punto procedimientos simples y rápidos basados en el análisis de perfiles proteicos que podrían implementarse fácilmente para análisis de rutina y rastreo de soja transgénica y no transgénica. Los perfiles proteicos se obtendrían empleando una técnica habitualmente existente en los laboratorios como es HPLC con fases estacionarias monolíticas y perfusivas. No hay ninguna metodología similar que se haya empleado para la detección de soja transgénica a pesar de que un procedimiento similar ya se había explorado con éxito para la identificación de cultivos de soja [15]. Sin embargo, se ha llevado a cabo recientemente por nuestro grupo de investigación la caracterización de cultivos transgénicos y no transgénicos de soja [16] y maíz [17] basada en el estudio de perfiles proteicos obtenidos por electroforesis capilar (CE) y HPLC, respectivamente. Estos estudios previos establecen las bases para hacer frente al reto de desarrollar procedimientos alternativos al análisis clásico de ADN basados en el análisis de proteínas.

Descripción de la invención

La invención consiste en dos procedimientos analíticos por HPLC en fase inversa empleando columnas monolíticas y de perfusión para la diferenciación rápida entre soja transgénica y no transgénica empleando perfiles proteicos cromatográficos obtenidos mediante los procedimientos descritos en la tabla 1.

Estas condiciones de separación se aplicaron a muestras disueltas en mezclas de agua:ACN (80:20 v/v) que permitían observar el mismo perfil proteico durante, al menos, una semana. Si el contenido acuoso era mayor las disoluciones eran más inestables y si el contenido orgánico aumentaba cambiaba el perfil proteico observado.

Las ventajas principales de los procedimientos cromatográficos para la diferenciación entre soja transgénica y no transgénica son las siguientes:

1. Procedimientos cromatográficos caracterizados porque permiten la diferenciación rápida entre soja transgénica (con tolerancia al glifosato) y no transgénica por Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC) en fase inversa empleando fases estacionarias monolíticas y perfusivas mediante el análisis de perfiles proteicos.

2. Procedimientos, según la reivindicación 1, que comprenden un tratamiento de muestra sencillo en el que las habas de soja se trituran, se toma una cantidad adecuada para conseguir una concentración de ~ 5 mg/mL en un medio compuesto por agua:acetonitrilo (ACN) (80:20, v/v), se sonica (10 min a 25ºC) y se centrifuga (10 min a 3362 g y 25ºC) previamente al análisis cromatográfico.

3. Procedimientos, según la reivindicación 1, que consisten en un gradiente binario y lineal en dos etapas con ACN-agua-ácido trifuoroacético (TFA) a un flujo de 3 mL/min que se basan en 5-30% (v/v) B en 6.0 min y 30-85% (v/v) B en 2.0 min para la columna monolítica y 5-25% (v/v) B en 1.7 min y 25-45% (v/v) B en 0.8 min para la de perfusión siendo la fase A: agua + TFA 0.1% (v/v) y la fase B: ACN + TFA 0.1% (v/v)

4. Procedimientos, según la reivindicación 1, caracterizados porque la separación de las proteínas de soja se realiza a una temperatura de 30ºC para la columna monolítica y de 60ºC para la de perfusión.

5. Procedimientos, según la reivindicación 1, caracterizados porque la detección de las proteínas de soja (aminoácidos aromáticos) se realiza por detección UV a 280 nm.

6. Procedimientos, según la reivindicación 1, caracterizados por servir para hacer un cribado rápido que permite diferenciar entre soja transgénica y no transgénica teniendo en cuenta los picos 8 y 9 para la columna monolítica y los picos 3 y 4 para la columna de perfusión.

7. Procedimientos, según la reivindicación 1, caracterizados porque requieren el empleo de técnicas multivariantes de análisis cluster (método de Ward) y de análisis discriminante para una diferenciación más rigurosa entre soja transgénica y no transgénica especialmente en el caso de que el contenido en material transgénico es pequeño.

8. Procedimientos, según la reivindicación 1, caracterizados por ser susceptibles de ser usados con otros tipos de soja transgénica, incluyendo los denominados organismos transgénicos de nueva generación.