PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION CUANTITATIVA DE DESMOPRESINA EN FLUIDOS ORGANICOS.

Procedimiento para la determinación cuantitativa de desmopresina en fluidos orgánicos que comprende la derivatización de una desmopresina de referencia,

la preparación de diferentes disoluciones con cantidades conocidas y diferentes de la desmopresina derivatizada y de desmopresina libre, el recubrimiento de una placa de pocillos con una disolución de un anticuerpo, la colocación en los pocillos de valoración de unos volúmenes determinados del fluido orgánico y otros volúmenes de las disoluciones en cantidad conocida de desmopresina derivatizada y de desmopresina libre, la incubación de la placa así preparada, el lavado de los pocillos, la adición de un nuevo ligando de alta afinidad, la incubación subsiguiente, el lavado de los pocillos, la adición un reactivo cromógeno, la medición de las absorbancias en los diferentes pocillos y su comparación con las absorbancias en una curva debidamente calibrada de absorbancia/concentración de desmopresina

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200800178.

Solicitante: LABORATORIOS LETI, S.L., SOCIEDAD UNIPERSONAL.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: FERNANDEZ PINILLA, RAMON, GUILEMANY CASADAMON,FRANCISCO.

Fecha de Solicitud: 24 de Enero de 2008.

Fecha de Publicación: 12 de Agosto de 2010.

Fecha de Concesión: 23 de Julio de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

G01N33/532 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Producción de compuestos inmunoquímicos marcados.

Clasificación PCT:

G01N33/532 G01N 33/00 […] › Producción de compuestos inmunoquímicos marcados.

Fragmento de la descripción:

Procedimiento para la determinación cuantitativa de desmopresina en fluidos orgánicos.

Objeto de la invención

Procedimiento para la rápida determinación del contenido de desmopresina en fluidos orgánicos mediante valoración colorimétrica.

Antecedentes de la invención

La 1-desamino-8-D-arginina-vasopresina o desmopresina, abreviada a dDAVP, es un péptido de uso farmacológico con estructura similar a la hormona humana vasopresina. La desmopresina se utiliza como medicamento de forma habitual en el tratamiento contra la enuresis o incontinencia de orina. También se utiliza en otros tratamientos, como por ejemplo, en ciertos tipos específicos de diabetes mellitus, o en condiciones producidas después de un traumatismo craneoencefálico o de cirugía en la glándula pituitaria, o bien para controlar la sensación de sed excesiva, o la deshidratación provocadas por lesiones, cirugías y ciertos trastornos médicos. Su administración se hace bajo la forma del trihidrato del acetato de desmopresina y la presentación galénica es variada: comprimidos, inyectables, nebulizador, o solución intranasal.

La eficacia del tratamiento con desmopresina se encuentra en relación directa con la cantidad de desmopresina libre presente en sangre o plasma del paciente.

Por otro lado, el exceso de desmopresina en el cuerpo produce un cuadro de intoxicación acuosa que en ocasiones puede ser acompañada de hipertensión arterial, convulsiones y coma. No existe antídoto específico. La necesidad de controlar la evolución del tratamiento impone por tanto la obligación de conocer la cantidad de desmopresina en sangre o plasma del paciente continuamente durante dicho tratamiento.

El estado actual de la técnica provee de medios analíticos cuantitativos para la determinación de desmopresina en los fluidos biológicos, pero esos medios son costosos, lentos y complejos, habiéndose de recurrir a costosas técnicas de cromatografía líquida de alta resolución o radioinmuno ensayo (radioimmune assay, RIA), de coste económico muy elevado.

Uno de los problemas metodológicos que se plantean a la hora de determinar la desmopresina es que al ser un análogo sintético de la vasopresina que actúa sobre los receptores VI y V2 de la vasopresina con una constante de disociación muy alta (5x10^-3 M), es decir con baja afinidad, no resulta útil el uso de dichos receptores como ligadores de desmopresina en un sistema ELISA (Enzyme-Linked ImmunoadSorbent Assay), a pesar de las ventajas simplificadoras que el reconocido sistema ELISA, con sus variantes, ofrece en las metodologías de numerosos análisis bioquímicos.

Otro de los problemas que se plantean a la hora de determinar desmopresina es que, al ser la molécula de desmopresina de tamaño comparativamente pequeño mientras que las moléculas de los anticuerpos habituales usados en las metódicas analíticas son comparativamente grandes, se hace inseguro que una misma molécula de desmopresina pueda estar unida simultáneamente a dos de estos anticuerpos, pues el volumen del primero de los dos puede estar impidiendo con cierta eficacia que el segundo se acerque lo suficiente hasta establecer el nuevo enlace. Por tanto, en el estado actual de la técnica tampoco existe un sistema ELISA de tipo sándwich fiable para la determinación cuantitativa de la desmopresina.

Existe una metodología ELISA en la que, recubriendo con la molécula de desmopresina y poniendo un anticuerpo específico marcado, se detecta cualitativamente si hay desmopresina fijada en la placa. Este ensayo no es útil para cuantificar la desmopresina exógena, ya que normalmente ésta no está pura y porque se recubre la placa con un exceso de desmopresina que al desprenderse de ésta, introduce un "ruido de fondo" en el ensayo que lo inutiliza a tal fin.

Descripción de la invención

El presente objeto de invención resuelve las complejidades y problemas actuales en el sistema ELISA para la determinación cuantitativa de la desmopresina recurriendo a los siguientes pasos o fases:

a) la derivatización de una desmopresina de referencia mediante la incorporación de un brazo espaciador y la purificación de la desmopresina derivatizada mediante cromatografía líquida de alta presión. b) la preparación de diferentes disoluciones o mezclas de valoración, con cantidades conocidas y diferentes de la desmopresina derivatizada y purificada previamente según la fase a) y de desmopresina libre. c) el recubrimiento de una placa ELISA o placa de pocillos con una disolución de un anticuerpo y a continuación con un tampón de bloqueo. d) la colocación en los pocillos de valoración de unos volúmenes determinados del fluido orgánico cuyo contenido en desmopresina se desea cuantificar y otros volúmenes determinados de las disoluciones en cantidad conocida de desmopresina derivatizada y desmopresina libre. e) la incubación de la placa con los pocillos rellenados a temperatura moderada durante un tiempo y a una temperatura determinados, de forma que la desmopresina libre y la desmopresina derivatizada compiten libremente por unirse al anticuerpo asegurándose que la cantidad de desmopresina derivatizada que se une al anticuerpo en cada pocillo es inversamente proporcional a la cantidad de desmopresina libre presente. f) el vaciado y lavado de los pocillos para eliminar todos los residuos de la reacción anterior, de forma que en cada pocillo permanecen únicamente las moléculas de desmopresina (tanto derivatizada como no derivatizada) unidas al anticuerpo. g) la adición de una disolución conteniendo un nuevo ligando de alta afinidad con algún grupo funcional presente en el brazo espaciador presente en la desmopresina derivatizada y con capacidad de reaccionar posteriormente con un reactivo cromógeno. h) la incubación subsiguiente de la placa con los pocillos rellenados a temperatura ambiente durante un tiempo determinado durante el que un grupo funcional en el brazo espaciador reacciona con el reactivo cromógeno. i) el vaciado y lavado de los pocillos para eliminar todos los residuos de la reacción anterior, de forma que en cada pocillo permanecen únicamente las moléculas del nuevo ligando referenciado en la fase g) encadenadas a la desmopresina derivatizada. j) la adición a cada pocillo de un reactivo cromógeno que genere un color de intensidad proporcional a la desmopresina derivatizada presente en el pocillo. k) La placa se deja reposar a temperatura ambiente durante un determinado tiempo. Durante este tiempo se genera un color. Finalmente se añade un reactivo para concluir la reacción de color. l) la determinación cuantitativa de la concentración de desmopresina en el fluido orgánico mediante la cuantificación en un colorímetro, a una determinada longitud de onda, de las absorbancias medias generadas en los diferentes pocillos en los que se colocaron las muestras de dicho fluido orgánico, para comparar a continuación dichas absorbancias medias con los valores de absorbancia media en una curva debidamente calibrada en cuya abscisa a escala logarítmica se representan unas concentraciones conocidas de desmopresina y en cuya ordenada a escala decimal se representa la absorbancia que corresponde a cada concentración.

Esta desmopresina derivatizada según el presente objeto de invención dispone de tres cualidades importantes para asegurar el resultado analítico:

1. La cinética de reacción de tanto la desmopresina como la de la desmopresina derivatizada es la misma frente a un número de anticuerpos de alta afinidad para la desmopresina. Cualquiera de estos anticuerpos de alta afinidad para la desmopresina será utilizado para retapizar las paredes de los pocillos en las metódicas ELISA previamente tapizadas con una IgG anti IgG. 2. La distancia espacial entre el grupo funcional de la parte desmopresina...

Reivindicaciones:

1. Procedimiento para la determinación cuantitativa de desmopresina en fluidos orgánicos caracterizado porque comprende las etapas o fases siguientes:

a) la derivatización de una desmopresina de referencia mediante la incorporación de un brazo espaciador y la purificación de la desmopresina derivatizada mediante cromatografía líquida de alta presión. b) la preparación de diferentes disoluciones o mezclas de valoración, con cantidades conocidas y diferentes de la desmopresina derivatizada y purificada previamente según la fase a) y de desmopresina libre. c) el recubrimiento de una placa ELISA o placa de pocillos con una disolución de un anticuerpo y a continuación con un tampón de bloqueo. d) la colocación en los pocillos de valoración de unos volúmenes determinados del fluido orgánico cuyo contenido en desmopresina se desea cuantificar y otros volúmenes determinados de las disoluciones en cantidad conocida de desmopresina derivatizada y de desmopresina libre. e) la incubación de la placa con los pocillos rellenados a temperatura moderada durante un tiempo y a una temperatura determinados, de forma que la desmopresina libre y la desmopresina derivatizada compiten libremente por unirse al anticuerpo asegurándose que la cantidad de desmopresina derivatizada que se une al anticuerpo en cada pocillo es inversamente proporcional a la cantidad de desmopresina libre presente. f)el vaciado y lavado de los pocillos para eliminar todos los residuos de la reacción anterior, de forma que en cada pocillo permanecen únicamente las moléculas de desmopresina (tanto derivatizada como no derivatizada) unidas al anticuerpo). g) la adición de una disolución conteniendo un nuevo ligando de alta afinidad con algún grupo funcional presente en el brazo espaciador presente en la desmopresina derivatizada y con capacidad de reaccionar posteriormente con un reactivo cromógeno. h) la incubación subsiguiente de la placa con los pocillos rellenados a temperatura ambiente durante un tiempo determinado durante el que un grupo funcional en el brazo espaciador reacciona con el reactivo cromógeno. i) el vaciado y lavado de los pocillos para eliminar todos los residuos de la reacción anterior, de forma que en cada pocillo permanecen únicamente las moléculas del nuevo ligando referenciado en la fase g) encadenadas a la desmopresina derivatizada. j) la adición a cada pocillo de un reactivo cromógeno que genere un color de intensidad proporcional a la desmopresina derivatizada presente en el pocillo. k) La placa se deja reposar a temperatura ambiente durante un determinado tiempo. Durante este tiempo se genera un color. Finalmente se añade un reactivo para concluir la reacción de color. l)la determinación cuantitativa de la concentración de desmopresina en el fluido orgánico mediante la cuantificación en un colorímetro, a una determinada longitud de onda, de las absorbancias medias generadas en los diferentes pocillos en los que se colocaron las muestras de dicho fluido orgánico, para comparar a continuación dichas absorbancias medias con los valores de absorbancia media en una curva debidamente calibrada en la que se representa dicha absorbancia media frente a la concentración de desmopresina libre.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el brazo espaciador utilizado en la fase a) para derivatizar la desmopresina es un reactivo de alta afinidad con la desmopresina.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo utilizado en la fase c) para recubrir la superficie interior de los pocillos es un anticuerpo alta afinidad con algún grupo presente en la desmopresina derivatizada o libre.

4. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el tampón de bloqueo contiene una alta concentración de proteína de fácil acceso.

5. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la incubación de los pocillos en la fase e) se efectúa a una temperatura comprendida entre 30ºC y 50ºC y durante un tiempo comprendido entre 2 horas y 6 horas.

6. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el lavado y vaciado de los pocillos en la fase f) se realiza entre 3 y 6 veces seguidas con una disolución salina.

7. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la incubación de los pocillos en la fase h) se realiza a temperatura ambiente durante un tiempo comprendido entre 15 y 60 minutos.

8. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el vaciado y lavado de los pocillos en la fase i) se realiza entre 3 y 6 veces seguidas con una disolución salina.

9. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque la disolución adicionada en la fase j) es una disolución acuosa de un reactivo cromógeno.

10. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado porque el tiempo en la fase k) para que se genere un color se encuentra comprendido entre 15 y 60 minutos.

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