Procedimiento para identificar y/o cuantificar la actividad anti-infecciosa de un compuesto anti-infeccioso,

comprendiendo dicho procedimiento:

(a) exposición de un organismo de prueba unicelular a un patógeno de un organismo huésped en ausencia del compuesto anti-infeccioso para la identificación y/o cuantificación;

(b) determinación de la relación entre la concentración del organismo de prueba unicelular y la del patógeno que permite al patógeno crecer en presencia del organismo de prueba unicelular;

(c) exposición del organismo de prueba unicelular al patógeno en la relación determinada en la etapa (b) en presencia del compuesto anti-infeccioso a identificar y/o cuantificar;

(d) exposición del organismo de prueba unicelular al patógeno en la relación determinada en la etapa (b) en ausencia del compuesto anti-infeccioso a identificar y/o cuantificar, y

(e) seguimiento del crecimiento del patógeno en presencia y ausencia del compuesto anti-infeccioso para la identificación y/o cuantificación, donde un nivel menor de crecimiento del patógeno en presencia del compuesto anti-infeccioso a identificar y/o cuantificar que el observado en ausencia del compuesto anti-infeccioso a identificar y/o cuantificar indica que el compuesto anti-infeccioso a identificar y/o cuantificar tiene una actividad anti-infecciosa

Procedimiento para identificar y/o cuantificar compuestos anti-infecciosos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para identificar y/o cuantificar la actividad anti-infecciosa de un compuesto. También se refiere a un procedimiento para identificar y/o cuantificar una mutación en un factor de virulencia de un patógeno de un organismo huésped que reduce la virulencia del patógeno a un organismo de prueba unicelular.

Antecedentes de la invención

La posibilidad de infección de un patógeno y la patogénesis implica la interacción de un patógeno con una célula huésped. Se ha demostrado que los factores que afectan a la patogénesis en plantas o animales también pueden afectar la patogénesis en organismos inferiores eucariotas. Por ejemplo, los mismos factores de virulencia bacteriana de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), que afectan al gusano Caenorhabdit elegans (C. elegans), también afectan a Arabidopsis thaliana y muestran virulencia en un ensayo de ratón mamífero tal y como se describe en WO 98/50080. Sin embargo, las propuestas de ensayo de posible infección y, en particular, de virulencia utilizando organismos multicelulares son laboriosas y costosas.

En WO 02/101081 se ha descrito un procedimiento que utiliza un organismo unicelular para la evaluación de la virulencia de un agente patógeno. Se ha utilizado la ameba unicelular Dictyostelium discoideum DH1-10 para evaluar la virulencia de un patógeno de un organismo huésped mediante la exposición de un cultivo de Dictyostelium discoideum DH1-10 al patógeno y el control del crecimiento de Dictyostelium en presencia del agente patógeno. Sin embargo, el método descrito en WO 02/101081 tiene ciertas limitaciones con respecto a la sensibilidad, la reproducibilidad y la cuantificación de la virulencia de un patógeno. Dado que la capacidad de un organismo cultivado depende de las condiciones de cultivo que podrían variar debido a ligeros cambios en el medio o la temperatura de cultivo, la sensibilidad del organismo de prueba unicelular con respecto al agente patógeno podría cambiar y, por lo tanto, sería difícil cuantificar y reproducir el ensayo de virulencia respectivo. Además, la valoración de la virulencia de un patógeno con el método descrito en WO 02/101081 es sólo semicuantitativo ya que el crecimiento de Dictyostelium se controla visualmente midiendo el diámetro de las colonias o midiendo el citoesqueleto del organismo con un microscopio óptico. Debido al hecho de que se controla el crecimiento del organismo de prueba unicelular, el ensayo descrito en WO 02/101081 consume mucho tiempo, es decir, el organismo de prueba unicelular debe tener que exponerse al patógeno durante 4-7 días. Este largo período de exposición podría ser por tanto la desventaja con respecto a una descomposición potencial del compuesto a ensayar.

Por lo tanto, existe la necesidad en el estado de la técnica de sistemas huésped de prueba unicelulares de menor consumo de tiempo, más sensibilidad y más reproducibilidad para ensayar la posibilidad de infección de patógenos que pueden utilizarse para medir cuantitativamente la virulencia de un patógeno y la actividad anti-infecciosa de un compuesto.

Descripción resumida de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar procedimientos mejorados para probar la posibilidad de infección de patógenos que no tengan los inconvenientes mencionados anteriormente. En un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para identificar y/o cuantificar la actividad anti-infecciosa de un compuesto anti-infeccioso, comprendiendo dicho procedimiento:

Adecuadamente, el procedimiento es un procedimiento para cuantificar IC₅₀ de un compuesto anti-infeccioso, comprendiendo dicho procedimiento:

Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para identificar y/o cuantificar una mutación en un factor de virulencia de un patógeno de un organismo huésped que reduce la virulencia del patógeno a un organismo de prueba unicelular, comprendiendo dicho procedimiento:

donde el mayor nivel de crecimiento del patógeno respecto al observado por el mutante del patógeno indica que el mutante del patógeno tiene una mutación en el factor de virulencia del patógeno que reduce la virulencia del patógeno hacia el organismo huésped.

Otros objetivos y ventajas serán evidentes para los expertos en la materia a partir de una revisión de la descripción detallada que sigue con referencia a las siguientes figuras ilustrativas y a las reivindicaciones relacionadas.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la matriz obtenida del ensayo Klebsiella pneumoniae y la evaluación del fenotipo de los mutantes y la potencia del compuesto ATH18534. Las líneas A, J a L y N a P son cepas de tipo salvaje Kp52145 (BAT39). Las filas B a I son cepas mutantes, BAT21, BAT30, BAT27, BAT146, BAT168, BAT172, BAT187 y BAT199, respectivamente....

1. Procedimiento para identificar y/o cuantificar la actividad anti-infecciosa de un compuesto anti-infeccioso, comprendiendo dicho procedimiento:

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el organismo de prueba unicelular se expone en la etapa (c) a la relación determinada en la etapa (b) e independientemente a una o varias concentraciones del patógeno en presencia del compuesto anti-infeccioso a identificar y/o cuantificar.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde simultáneamente a y bajo las mismas condiciones de la etapa c) y d) el patógeno se expone sin el organismo de prueba unicelular en presencia y ausencia del compuesto anti-infeccioso a identificar y/o cuantificar, y el crecimiento del patógeno en presencia y ausencia del compuesto anti-infeccioso a identificar y/o cuantificar se controla en la correspondiente etapa (d), donde se utiliza el nivel de crecimiento obtenido para el patógeno en presencia y ausencia del compuesto anti-infeccioso a identificar y/o cuantificar para calcular la actividad antibiótica del compuesto anti-infeccioso y para discriminar la actividad de antivirulencia de la actividad antibiótica del compuesto anti-infeccioso.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el compuesto anti-infeccioso a identificar y/o cuantificar se selecciona entre:

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el procedimiento es un procedimiento para cuantificar IC₅₀ de un compuesto anti-infeccioso, donde las etapas (c) a (e) del procedimiento son como siguen:

6. Procedimiento según la reivindicación 5, donde el organismo de prueba unicelular se expone al patógeno en la etapa c), además de forma independiente en presencia de un compuesto estándar y el crecimiento del patógeno se controla en la etapa (e) de forma independiente, en presencia de dos o más concentraciones del compuesto anti-infeccioso, en ausencia del compuesto anti-infeccioso y en presencia de un compuesto estándar, y donde el nivel de crecimiento del patógeno en presencia de dos o más concentraciones del compuesto anti-infeccioso, el nivel de crecimiento del patógeno en ausencia del compuesto anti-infeccioso y el nivel de crecimiento en presencia de un compuesto estándar se utilizan para calcular el IC₅₀ del compuesto anti-infeccioso.

7. Procedimiento para identificar y/o cuantificar una mutación en un factor de virulencia de un patógeno de un organismo huésped que reduce la virulencia del patógeno a un organismo de prueba unicelular, comprendiendo dicho procedimiento:

donde el mayor nivel de crecimiento del patógeno respecto al observado por el mutante del patógeno indica que el mutante del patógeno tiene una mutación en el factor de virulencia del patógeno que reduce la virulencia del patógeno al organismo huésped.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, donde el organismo de prueba unicelular está expuesto a la relación determinada en la etapa (d) e independiente a una o más concentraciones del patógeno y el mutante en las etapas (e) y (f), y donde se controla el crecimiento del patógeno y el crecimiento del mutante expuesto a la relación determinada en la etapa (d) e independientemente a una o más concentraciones del organismo de prueba unicelular en la etapa g).

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el organismo de prueba unicelular es un protozoo fagocítico opcionalmente seleccionado entre una ameba fagocítica, flagelada o ciliada.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, donde el organismo de prueba unicelular es Tetrahymena.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, donde Tetrahymena es Tetrahymena piriformis o Tetrahymena termófila.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde el patógeno se selecciona entre el grupo que consiste en bacterias, micobacterias, hongos y organismos eucariotas unicelulares.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, donde el patógeno es un patógeno bacteriano extracelular.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, donde el patógeno bacteriano extracelular se selecciona entre el grupo que consiste en Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, donde el organismo huésped es un vertebrado.