Molécula de ácido nucleico aislada de la planta del café (Coffea spp.

), que presenta una secuencia codificante que codifica una deshidrina, en la que la deshidrina presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 7 ó 8

Genes de deshidrina y promotores procedentes del café.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología agrícola. En particular, la invención proporciona polinucleótidos codificantes de deshidrina procedentes de plantas del café, secuencias promotoras procedentes de genes deshidrina del café, y métodos para utilizar dichos polinucleótidos y promotores para la regulación génica y la manipulación del sabor, aroma y otras características de los granos del café.

Antecedentes de la invención

Se citan diversas publicaciones, incluyendo patentes, solicitudes publicadas y artículos especializados, durante toda la memoria. Cada una de estas publicaciones se incorpora como referencia en su totalidad en la presente memoria. Las citaciones no indicadas por completo en la memoria pueden encontrarse al final de la misma.

El aroma y sabor del café son componentes clave en la preferencia del consumidor para variedades y marcas de café. El aroma y sabor característicos del café se originan en una compleja serie de reacciones químicas que implican precursores del sabor (reacciones de Maillard) que se producen durante el tueste del grano. Entre los precursores del sabor se incluyen compuestos químicos y moléculas biológicas presentes en el grano verde del café. Hasta hoy, se han identificado más de 800 compuestos químicos y moléculas biológicas como contributivas al sabor y aroma del café (Montavon et al., J. Agric. Food Chem. 51:2328-34, 2003).

Debido a que los consumidores del café son crecientemente sofisticados, resulta deseable producir café con aroma y sabor mejorados para satisfacer las preferencias del consumidor. Tanto aroma como sabor pueden proporcionarse artificialmente a los productos del café por medios químicos (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.072.761 (aroma) y la patente US nº 3.962.321 (sabor)). Sin embargo, hasta hoy, existen pocos datos sobre la influencia de los componentes naturales del grano del café, tales como polisacáridos, proteínas y lípidos sobre el aroma y sabor del café. Un enfoque es seleccionar variedades de entre el plasma germinal existente que presenten características de sabor superiores. Una desventaja de este enfoque es que, frecuentemente, las variedades de calidad más alta también presentan características agronómicas negativas significativas, tales como un rendimiento pobre y una baja resistencia a enfermedades y a fuentes de estrés ambiental. También resulta posible seleccionar nuevas variedades de ensayos de cultivo cruzando variedades con diferentes características industriales y agronómicas, cribando la progenie para tanto alta calidad como buen rendimiento agronómico. Sin embargo, este último enfoque resulta muy laborioso, debido a que un experimento de cruzamiento y selección a lo largo de tres estaciones de crecimiento requiere un mínimo de 7 a 8 años. De esta manera, un enfoque alternativo para incrementar la calidad del café sería utilizar técnicas de biología molecular para potenciar aquellos elementos responsables del sabor y el aroma presentes naturalmente en el grano del café, o añadir elementos potenciadores del aroma y el sabor que no se encuentran naturalmente en los granos del café. La manipulación genética resulta particularmente adecuada para conseguir estos objetivos. Por ejemplo, pueden intercambiarse proteínas del café de diferentes especies de café. Alternativamente, puede potenciarse la expresión de genes codificantes de proteínas naturales del café que contribuyen positivamente al sabor del café. A la inversa, puede suprimirse la expresión de genes codificantes de proteínas naturales del café que contribuyen negativamente al sabor del café. Otra aplicación de las técnicas modernas es la utilización de información molecular referente a la asociación entre calidad elevada y alelos específicos para el cribado de nuevas variedades para la presencia o ausencia de los mismos, realizando cruces asistidos por marcadores.

Los cafés de diferentes variedades y orígenes muestran variaciones significativas de calidad del sabor y aroma tras tostar y procesar las muestras de grano verde de la misma manera. Las diferencias de calidad son una manifestación de las variaciones químicas y físicas en las muestras de grano que resultan principalmente de diferencias en las condiciones de crecimiento y procesamiento, y también de diferencias en el fondo genético tanto de la planta madre como del grano. Al nivel de la composición química, por lo menos parte de la calidad del sabor puede asociarse a variaciones de los niveles de metabolitos de tamaño reducido, tales como azúcares, ácidos, fenólicos y cafeína, que se han encontrado asociados al grano de diferentes variedades. Se acepta que existen otras moléculas del sabor y de precursores del sabor no tan bien caracterizadas. Además, es probable que variaciones estructurales en el grano también contribuyan a las diferencias de calidad del café. Un enfoque para encontrar nuevos componentes en el grano del café ligados a la calidad del mismo es estudiar los genes y proteínas expresadas diferencialmente durante la maduración de muestras de grano de diferentes variedades que presentan diferentes características de calidad.

Se ha demostrado que un grupo de proteínas denominadas proteínas abundantes en la embriogénesis tardía (LEA) se acumulan de manera coordinada durante las últimas etapas del desarrollo de la semilla del algodón (Dure L. et al., Biochemistry 20:4162-4178, 1981). Las proteínas de la deshidrina (DHN) son un subgrupo de proteínas LEA que también se han denominado "familia de LEA D-11" o proteínas LEA de tipo 2 (Close T., Physiol. Plant 97:795-803, 1996; Ingram J., Annu. Rev. Plant Physiology Plant Mol. Biol. 47:377-403, 1996). La expresión de las proteínas DHN se ha asociado a la protección de diversos tipos de células vegetales frente a tensiones osmóticas, tales como las causadas por la desecación, las sales y las temperaturas bajas (Skriver K. et al., Plant Cell 2:503-512, 1990; Allagulova C.R. et al., Biochemistry-Moscow 68:945-951, 2003).

En los últimos años, los datos experimentales directos han relacionado la expresión incrementada de las deshidrinas con la protección frente al estrés osmótico. Por ejemplo, se ha encontrado que las plantas de Arabidopsis manipuladas para sobreexpresar una proteína de fusión de deshidrina presentan una supervivencia mejorada al exponerlas a bajas temperaturas (Puhakainen T. et al., Plant Molecular Bology 54:743-753, 2004). De manera similar, la expresión de una proteína deshidrina de citrus en tabaco transgénico se ha demostrado que proporciona una tolerancia incrementada frente a las temperaturas bajas (Hara M. et al., Planta 217:290-298, 2003). Otros datos que corroboran la relación entre las deshidrinas y la tolerancia al estrés inducido por temperaturas bajas se refieren a observaciones de que los loci QTL para la tolerancia a la congelación y la resistencia invernal se localizan en sitios muy próximos a las deshidrinas (Close T., 1996; Zhu B. et al., Molecular and General Genetics 264:145-153, 2000). Los genes DHN también se expresan robustamente en las semillas hacia el final de la maduración, un periodo en el que la semilla experimenta una reducción del contenido de agua programada dentro del desarrollo (Nylander M. et al., Plant Molecular Biology 45:263-279, 2001; Choi D.W. et al., Theoretical and Applied Genetics 100:1274-1278, 2000). Las proteínas LEA/deshidrina se ha estimado que comprenden hasta 4% de las proteínas totales de la semilla, y se cree que se encuentran implicadas en la protección del embrión y/o de otros tejidos de la semilla frente a fuentes de estrés osmótico asociadas a un bajo contenido de agua de la semilla madura (Roberts J. et al., Plant Cell 5:769-780, 1993; Wise M. et al., Trends Plant Sci. 9:13-17, 2004).

Es una percepción generalizada que las deshidrinas participan, además de otras proteínas LEA, en el proceso de deshidratación que se produce durante las últimas etapas de la maduración de la semilla, al ayudar a la aclimatación de los tejidos de la semilla al menor contenido de agua presente en las semillas maduras (Close T.M., 1996; Nylander M., 2001). Además, se cree que las deshidrinas sintetizadas por semillas durante la maduración también continúan estabilizando las estructuras celulares asociadas durante la quiescencia de la semilla. En este último contexto, recientemente se ha propuesto que las deshidrinas también podrían presentar una capacidad de secuestro de radicales (Hara M., 2003) y propiedades ligantes de metales (Alsheikh...

1. Molécula de ácido nucleico aislada de la planta del café (Coffea spp.), que presenta una secuencia codificante que codifica una deshidrina, en la que la deshidrina presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las secuencias SEC ID nº 7 ó 8.

2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, en la que la secuencia codificante es 90% o más idéntica a cualquiera de las secuencias codificantes proporcionadas en las secuencias SEC ID nº 1 y 2.

3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 2, en la que la secuencia codificante comprende cualquiera de las secuencias SEC ID nº 1 y 2.

4. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que es un gen que presenta un marco de lectura abierto que comprende la secuencia codificante.

5. Molécula de ARNm producida mediante transcripción del gen según la reivindicación 4.

6. Molécula de ADNc producida mediante transcripción inversa de la molécula de ARNm según la reivindicación 5.

7. Vector que comprende la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, preferentemente un vector de expresión seleccionado de entre el grupo de vectores que consiste de plásmido, fagémido, cósmido, baculovirus, bácmido, y vectores bacteriano, levadura y vírico.

8. Vector según la reivindicación 7, en el que la secuencia codificante de la molécula de ácido nucleico se encuentra operablemente ligada a un promotor seleccionado de entre: un promotor constitutivo, un promotor inducible, un promotor específico de tejido y un promotor específico de las semillas.

9. Vector según la reivindicación 8, en el que el promotor específico de las semillas es un promotor específico de las semillas del café, preferentemente un promotor del gen de la deshidrina, todavía más preferentemente en el que el promotor del gen de la deshidrina comprende la secuencia SEC ID nº 13.

10. Célula huésped transformada con el vector según la reivindicación 7, preferentemente seleccionada de entre el grupo que consiste de células vegetales, células bacterianas, células fúngicas, células de insecto y células de mamífero.

11. Célula huésped según la reivindicación 10, que es una célula vegetal seleccionada de entre el grupo de plantas que consiste de las plantas del café, tabaco, Arabidopsis, maíz, trigo, arroz, soja, cebada, centeno, avena, sorgo, alfalfa, trébol, canola, azafrán, girasol, cacahuete, cacao, tomate, tomatillo, patata, pimiento, berenjena, remolacha azucarera, pepino, lechuga, guisante, aster, begonia, crisantemo, delfinio, zinia y hierbas de césped.

12. Planta transgénica fértil producida mediante regeneración de la célula huésped según la reivindicación 11.

13. Planta transgénica fértil según la reivindicación 12, que es Coffea spp.