GEN DE FUSION EML4-ALK.
Procedimiento para detectar un gen de fusión del gen de la proteína 4 similar a proteína asociada a microtúbulos equinodermos (EML4) y gen de cinasa de linfoma anaplásico (ALK) que comprende la etapa de detectar la presencia de un polinucleótido en una muestra obtenida de un sujeto de prueba,
en el que el polinucleótido codifica un polipéptido seleccionado del grupo que está constituido por:
(1) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa,
(2) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 con la deleción, sustitución y/o inserción de 1 a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa,
(3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa, y
(4) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130
Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E07254044.
Solicitante: ASTELLAS PHARMA INC.
CUREGENE K.K.
Nacionalidad solicitante: Japón.
Dirección: 3-11, NIHONBASHI-HONCHO 2-CHOME, CHUO-KU,TOKYO 103-8411.
Inventor/es: SHINDO, NOBUAKI, SOGA,TAKATOSHI, MANO,HIROYUKI, KUROMITSU,SADAO, FURUTANI,TAKASHI.
Fecha de Publicación: .
Fecha Solicitud PCT: 11 de Octubre de 2007.
Fecha Concesión Europea: 2 de Diciembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/47 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de mamíferos.
- C12N9/12B1
Clasificación PCT:
- C07K14/435 C07K 14/00 […] › de animales; de humanos.
Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.
Fragmento de la descripción:
Gen de fusión EML4-ALK.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a un polipéptido como proteína de fusión novedosa, a un procedimiento para detectar la proteína de fusión o a un polinucleótido que codifica el polipéptido y materiales relacionados.
Hasta ahora se conocen varios genes relacionados con el cáncer. En particular, se ha mostrado que los genes de tirosina cinasa, que codifican importantes enzimas que regulan directamente el crecimiento celular, se activan incluso por sustitución o deleción en secuencias de aminoácidos y así provocan carcinogénesis.
Por ejemplo, NPM-ALK, los genes de fusión que codifican NPM fusionada con la tirosina cinasa ALK, se observan en más de la mitad de los casos de linfoma anaplásico de células grandes (LACG) y se ha mostrado que la activación de la cinasa ALK es importante para el crecimiento de células tumorales por NPM-ALK (documentos de no patente 25 y 14).
Se ha informado la presencia de un nuevo tipo de cinasa anormal que se encuentra en aproximadamente el 10% de los casos de cáncer de pulmón y, sin embargo, este informe no ha hecho referencia a moléculas específicas (documento de no patente 2).
En 2000 se informó EML4 (proteína 4 similar a proteína asociada a microtúbulos equinodermos) (documento de no patente 3). La proteína EML4 tiene una región básica en el extremo amino, y adicionalmente tiene dominios WD en el extremo carboxilo (documento de no patente 8). Se conocen poco las funciones fisiológicas de EML4.
Por otra parte, la ALK (cinasa de linfoma anaplásico) (documento de no patente 4) es tirosina cinasa receptora (documento de no patente 5).
La expresión de ALK de longitud completa se ha informado hasta ahora en algunas células cancerosas de origen ectodérmico tales como neuroblastoma, glioblastoma, cáncer de mama y melanoma (no se ha observado la expresión de ALK de longitud completa en células cancerosas de orígenes endodérmicos y mesodérmicos) (documento de no patente 13). La ALK de longitud completa se expresa en muchas líneas celulares de neuroblastoma. Sin embargo, la autofosforilación de ALK no se observa en estas líneas celulares de neuroblastoma. Además, a partir del análisis de cohorte de pacientes con neuroblastoma se ha informado que la expresión de ALK está débilmente asociada al cáncer. Se ha sugerido que la expresión de ALK en neuroblastoma puede reflejar su expresión en diferenciación neural normal, en vez de su asociación a cáncer (documento de no patente 10). Por otra parte, en casos informados, ligandos tales como pleiotrofina y midcina, además de la amplificación génica de la propia ALK, aumentan la autofosforilación de ALK y movilizan señales intracelulares. También se ha informado que la ALK puede contribuir al crecimiento de células cancerosas (documento de no patente 12).
En algunos casos de linfoma maligno humano y tumor miofibroblástico inflamatorio se ha informado que el gen ALK está fusionado a otros genes (NPM, CLTCL, TFG, CARS, SEC31L1, etc.) como resultado de translocalización o inversión cromosómica y así forma un tipo de fusión de tirosina cinasa (documentos de no patente 9, 11, 14 a 19 y 26 a 28). Además, se ha informado un procedimiento para identificar una proteína como componente de fusión para ALK usando anticuerpos de ALK (documento de no patente 6). Por otra parte, no se ha informado de un gen de fusión de EML4 y ALK. Debido a que la mayoría de las moléculas tienen un dominio de formación de complejos, no se ha pensado que la propia proteína de fusión forme un complejo. Se ha considerado que esta formación de complejos produce la pérdida de control de la actividad de tirosina cinasa de ALK e induce carcinogénesis con señales intracelulares anormalmente activadas (documento de no patente 10). De hecho, se ha informado que el uso de ARNhc de ALK o compuesto inhibidor de cinasa ALK para células de linfoma que expresan proteínas de fusión de ALK puede inducir inhibición del crecimiento celular y muerte celular. Por tanto, se ha sugerido que la proteína de fusión ALK puede servir de diana terapéutica para linfoma y tumor miofibroblástico inflamatorio (documentos de no patente 20 a 22). También se ha sugerido que la ALK puede servir de diana terapéutica para otros cánceres cuyo crecimiento implica ALK como se describe anteriormente (documentos de no patente 21 a 22).
Marzec y col. han informado que WHI-P131 y WHI-P154 (ambos, EMD Biosciences), que se han utilizado como sustancias inhibidoras de tirosina cinasa JAK3, inhiben la actividad de NPM-ALK (documento de no patente 22). Otro grupo ha informado que el inhibidor de ALK de bajo peso molecular induce la muerte celular de líneas celulares de linfoma que expresan NPM-ALK (documento de no patente 21). Además, hasta ahora se han notificado varios compuestos de bajo peso molecular que tienen una actividad inhibitoria contra ALK (documentos de no patente 23 y 24 y documentos de patente 1 a 3).
[Documento de patente 1] Panfleto de documento WO 2004/080980
[Documento de patente 2] Panfleto de documento WO 2005/009389
[Documento de patente 3] Panfleto de documento WO 2005/016894
[Documento de no patente 1] "The New England journal of medicine", (EE.UU.), 2005, vol. 353, pág. 172-187
[Documento de no patente 2] Proceedings of the 65th Annual Meeting of the Japanese Cancer Association, O-324 (concedida el 28 de agosto de 2006)
[Documento de no patente 3] número de registro de GenBank: NM_019063
[Documento de no patente 4] número de registro de GenBank: AB209477
[Documento de no patente 5] Oncogene. 30 de enero de 1997; 14 (4): 439-49
[Documento de no patente 6] PNAS 2006 103, 7402-7407
[Documento de no patente 7] "Seminars in oncology", (EE.UU.), 1993, vol. 20, pág. 105-127
[Documento de no patente 8] "Genomics", (EE.UU.), 2000, vol. 68, pág. 348-350
[Documento de no patente 9] Oncogene 9: 1567-1574, 1994
[Documento de no patente 10] "Cellular and molecular life sciences", (Suiza), 2004, vol. 61, pág. 2939-2953
[Documento de no patente 11] Am J Patol 160: 1487-1494, 2002
[Documento de no patente 12] "Journal of cellular physiology", (EE.UU.), 2004, vol. 199, pág. 330-358
[Documento de no patente 13] "International journal of cancer", (EE.UU.), 2002, vol. 100, pág. 49-56
[Documento de no patente 14] "Science", (EE.UU.), 1994, vol. 263, pág. 1281-1284
[Documento de no patente 15] "Blood", (EE.UU.), 1995, vol. 86, pág. 1954-1960
[Documento de no patente 16] "Blood", (EE.UU.), 2000, vol. 95, pág. 3204-3207
[Documento de no patente 17] "Blood", (EE.UU.), 1999, vol. 94, pág. 3265-3268
[Documento de no patente 18] "Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology", (EE.UU.), 2003, vol. 83, pág. 1255-1265
[Documento de no patente 19] "International journal of cancer", (EE.UU.), 2006, vol. 118, pág. 1181-1186
[Documento de no patente 20] "Blood", (EE.UU.), 2006, vol. 107, pág. 689-697
[Documento de no patente 21] "Blood", (EE.UU.), 2006, vol. 107, pág. 1617-1623
[Documento de no patente 22] "Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology", (EE.UU.), 2005, vol. 85, pág. 1544-1554
[Documento de no patente 23] "Journal of medicinal chemistry", (EE.UU.), 2006, vol. 49, pág. 1006-1015
[Documento de no patente 24] J Comb Chem. 8: 401-409, 2006
[Documento de no patente 25] "Science", (EE.UU.), 1997, vol. 278, pág. 1309-1312
[Documento de no patente 26] Am J Patol 157: 377-384, 2000
[Documento de no patente 27] Blood 90: 2901-2910, 1997
[Documento de no patente 28] Am J Patol. 2000 Mar; 156 (3): 781-9.
Resumen de la invención
Los presentes inventores aislaron satisfactoriamente, a partir de muestras obtenidas de pacientes con cáncer de pulmón, el ADNc y el ADN genómico de un novedoso polinucleótido de fusión de un gen EML4 parcial fusionado con un gen ALK parcial como cinasa (denominado en lo sucesivo un polinucleótido de fusión de EML4-ALK v1), que se produce por inversión cromosómica (Ejemplos 1, 2, y 4(1)). Los presentes inventores también aislaron satisfactoriamente el ADNc y el ADN genómico de un novedoso polinucleótido...
Reivindicaciones:
1. Procedimiento para detectar un gen de fusión del gen de la proteína 4 similar a proteína asociada a microtúbulos equinodermos (EML4) y gen de cinasa de linfoma anaplásico (ALK) que comprende la etapa de detectar la presencia de un polinucleótido en una muestra obtenida de un sujeto de prueba, en el que el polinucleótido codifica un polipéptido seleccionado del grupo que está constituido por:
- (1) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa,
- (2) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 con la deleción, sustitución y/o inserción de 1 a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa,
- (3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa, y
- (4) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130.
2. Procedimiento para detectar una proteína de fusión codificada por un gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK que comprende la etapa de detectar la presencia de un polipéptido en una muestra obtenida de un sujeto de prueba, en el que el polipéptido se selecciona del grupo que está constituido por:
- (1) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa,
- (2) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 con la deleción, sustitución y/o inserción de 1 a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa,
- (3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa, y
- (4) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEX ID NO: 2, 7 ó 130.
3. Procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa.
4. Procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el polipéptido está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130.
5. Procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa.
6. Procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el polipéptido está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7.
7. Kit para la detección de un gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK que comprende cebadores sentido y antisentido que amplifican específicamente un polinucleótido que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que está constituido por:
- (1) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa,
- (2) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 con la deleción, sustitución y/o inserción de 1 a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de cinasa,
- (3) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con el 90% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa, y
- (4) un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130.
8. Kit de la reivindicación 7, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130 y que tiene una actividad de cinasa.
9. Kit de la reivindicación 7, en el que el polipéptido está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 7 ó 130.
10. Kit de la reivindicación 7, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa.
11. Kit de la reivindicación 7, en el que el polipéptido está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7.
12. Conjunto de cebadores para detectar un gen de fusión del gen EML4 y el gen ALK, en el que el conjunto de cebadores se selecciona del siguiente a) - c):
13. Conjunto de cebadores de la reivindicación 12, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7 y que tiene una actividad de cinasa.
14. Conjunto de cebadores de la reivindicación 12, en el que el polipéptido está constituido por la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 ó 7.
15. Conjunto de cebadores de un cebador sentido que comprende un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 1 a 2242 en SEQ ID NO: 6 y un cebador antisentido que comprende un oligonucleótido complementario a un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 2243 a 3933 en SEQ ID NO: 6, o un conjunto de cebadores que está constituido por cadenas complementarias de los mismos, en el que los cebadores sentido y antisentido dan productos de amplificación de 1 kb o menos de tamaño.
16. Conjunto de cebadores de un cebador sentido que comprende un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 1 a 3629 en SEQ ID NO: 4 y un cebador antisentido que comprende un oligonucleótido complementario a un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 3630 a 3979 en SEQ ID NO: 4, o un conjunto de cebadores que está constituido por cadenas complementarias de los mismos, en el que los cebadores sentido y antisentido dan productos de amplificación de 1 kb o menos de tamaño.
17. Conjunto de cebadores de un cebador sentido que comprende un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 1 a 579 en SEQ ID NO: 5 y un cebador antisentido que comprende un oligonucleótido complementario a un oligonucleótido con al menos todas las 16 bases consecutivas localizadas en los nº de bases 580 a 853 en SEQ ID NO: 5, o un conjunto de cebadores que está constituido por cadenas complementarias de los mismos.
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