PROCEDIMIENTO DE FERMENTACION PARA LA PRODUCCION DE TOXINA DE LA DIFTERIA.

Un procedimiento de fermentación que comprende una etapa de fermentación de crecimiento de una cepa de Corynebacterium diphtheria en un medio en un fermentador en condiciones de agitación suficiente para mantener un cultivo homogéneo y aireación limitada de manera que la pO2 dentro del cultivo descienda a menos del 4% para la mayoría de la etapa de fermentación en el que la etapa de fermentación tiene lugar en a) un fermentador de 100 a 250 litros a un KLa de 30 a 60 h-1 o b) en un fermentador de 250 a 800 litros a un KLa de 60-150 h-1

Procedimiento de fermentación para la producción de toxina de la difteria.

La presente invención se refiere al campo de los antígenos de la difteria, en particular toxinas (incluyendo formas mutantes de toxina de la difteria, como CRM197) y al procedimiento de fermentación para la fabricación de cultivos en volumen de dichos antígenos.

La toxina de la difteria es una exotoxina de proteínas producida por la bacteria Corynebacterium diphtheria. Se produce como un polipéptido único que se divide fácilmente para formar dos subunidades ligadas por un enlace de disulfuro, Fragmento A y Fragmento B, como consecuencia de la escisión en el residuo 190, 192 ó 193 (Moskaug y col., Biol. Chem. 264: 15709-15713, 1989). El Fragmento A es la parte catalíticamente activa y es una ADP-ribosiltransferasa dependiente de NAD que se dirige específicamente al factor de síntesis de proteínas EF-2, inactivando con ello EF-2 e impidiendo la síntesis de proteínas en una célula.

La inmunidad a una toxina bacteriana como la toxina de la difteria puede adquirirse naturalmente durante el curso de una infección, o artificialmente por inyección de una forma destoxificada de la toxina (toxoide) (Germanier, er, Bacterial Vaccines, Academic Press, Orlando, Fl., 1984). Los toxoides se han preparado tradicionalmente mediante modificación química de toxinas nativas (Lingood y col., Brit. J. Exp. Path. 44; 177, 1963), haciéndolos no tóxicos a la vez que se conserva la antigenicidad que protege al animal vacunado contra provocación posterior por la toxina natural. Alternativamente, se han descrito varias toxinas de la difteria mutadas que tienen toxicidad reducida (documentos US-4.709.017, US-4.950.740).

CRM197 es una forma no tóxica de la toxina de la difteria pero que es inmunológicamene indistinguible de la toxina de la difteria. CRM197 es producida por C. diphtheriae infectada por la fase no toxígena ß197tox- creada por mutagénesis de nitrosoguanidina del corynefago toxígeno b (Uchida y col., Nature New Biology (1971) 233; 8-11). La proteína CRM197 tiene el mismo peso molecular que la toxina de la difteria pero difiere de ella por un único cambio de base en el gen estructural. Esto conduce a un cambio de glicina por glutamina de aminoácido en posición 52 que hace el fragmento A incapaz de unirse a NAD y por tanto no tóxico (Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46; 69-94, Rappuoli Applied and Environmental Microbiology Sept 1983 pág. 560-564).

El toxoide de la difteria y una forma mutante con toxicidad reducida, CRM197, son componentes de muchas vacunas para proporcionar inmunidad contra Corynebacterium diphtheriae. Se conocen varias vacunas de combinación que pueden prevenir Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae y opcionalmente virus de Hepatitis B y/o Haemophilus influenzae tipo b (véanse, por ejemplo, los documentos WO-93/24.148 y WO-97/00.697, W0-02/055.105).

También se han usado toxina de la difteria y formas mutantes que incluyen CRM197 en vacunas como vehículos seguros y eficaces dependientes de células T para sacáridos. CRM197 se usa en la actualidad en la vacuna conjugada CRM197 de oligosacárido de Haemophilus influenzae tipo b (HibTitre®; Lederle Praxis Biologicals, Rochester, N.Y.).

Los procedimientos para preparar toxoide de difteria (TD) son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, TD puede producirse por purificación de la toxina a partir de un cultivo de Corynebacterium diphtheriae seguido de destoxificación química, o puede prepararse por purificación de un análogo recombinante, o destoxificado genéticamente de la toxina (por ejemplo, CRM197, u otros mutantes según se describe en los documentos US-4.709.017, US-5.843.711, US-5.601.827 y US-5.917.017). Corynebacterium diphtheriae se cultiva en condiciones aerobias. Rappuoli y col. (Biotechnology febrero 1985, pág. 161-163) sugieren que la pO2 debe regularse al 25% mediante aireación con una mezcla de aire y oxígeno que se regula automáticamente para mantener la pO2 deseada.

La producción de cantidades importantes de toxinas de la difteria como CRM197 para su uso en vacunas se ha visto obstaculizada debido a la baja abundancia de proteínas. Este problema se ha abordado previamente mediante la introducción de copias adicionales de un gen que codifica la toxina de la difteria o una forma mutante en Corynebacterium diphtheriae (documentos US-4.925.792; US-5.614.382). Dichos procedimientos conducen a un aumento en la producción de aproximadamente el triple. Los procedimientos de mejora adicional de rendimientos de toxina de la difteria en una forma reproducible serían beneficiosos para permitir niveles más altos de producción de estos valiosos antígenos.

En consecuencia, la presente solicitud proporciona un procedimiento de fermentación mejorado que comprende una etapa de fermentación de cultivo de una cepa de Corynebacterium diphtheria en medio en un fermentador en condiciones de agitación suficiente para mantener un cultivo homogéneo y aireación limitada de manera que la pO2 dentro del cultivo descienda a menos del 4% para la mayoría de la etapa de fermentación.

La fermentación tiene lugar en condiciones aerobias, aunque de aireación limitada, de manera que se usa oxígeno hasta que entra en el cultivo durante la mayoría de la fermentación, es decir, después de la fase inicial en la que la densidad de C. diphtheriae es relativamente baja y los niveles de pO2 pueden ser más altos. Los autores de la invención encontraron que el cultivo en dichas condiciones produce una expresión más eficaz y/o consistente de toxina de la difteria o mutante en comparación con los procedimientos de fermentación efectuados a pO2 más alta. El procedimiento de la invención es más sólido que la fermentación a niveles más altos de oxígeno, y permite rendimientos de toxina de la difteria que se mantienen altos incluso cuando el medio de cultivo contiene hierro añadido o cuando se usan materias primas complejas de calidad variable.

En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para fabricar una preparación de toxina de la difteria o mutante de la misma que comprende efectuar el procedimiento de fermentación de la invención y aislar la toxina de la difteria o mutante de la misma del cultivo. Aunque la toxina de la difteria y los mutantes se describen en la presente memoria descriptiva, se plantea que puede aislarse cualquier antígeno de C. diphtheríae usando el procedimiento de la invención.

El uso de dicho procedimiento produce rendimientos más elevados de toxina de la difteria o mutante, por ejemplo CRM197, en comparación con cuando se mantiene la pO2 al 5% o superior, por ejemplo el 20%.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona un uso de la toxina de la difteria o mutante de la misma de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedad bacteriana, en particular enfermedad por C. diphtheriae.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona un procedimiento para prevenir o tratar infección bacteriana, en particular infección por C. diphtheriae que comprende la administración de la composición farmacéutica de la invención a un paciente.

Descripción de las figuras

Fig. 1 Gráficos que muestran el perfil de oxigenación y su uso para determinar el KLa de una fermentación. El cuadro A muestra el curso temporal de la oxigenación después de un cambio de nitrógeno a aire. El cuadro B muestra una representación de ln(100-pO2) con respecto al tiempo que permite la evaluación de KLa mediante la determinación del gradiente de la línea.

Fig. 2 Visión general de un procedimiento de fermentación para C. diphtheriae.

Fig. 3 Gráfico que muestra la cinética típica de crecimiento de un cultivo de C. diphtheriae. La línea con marcadores circulares muestra la DO a 650 nm después de varios tiempos de cultivo. La línea marcada con rombos muestra el pH del cultivo.

Fig. 4 Geles SDS-PAGE de sobrenadantes de cultivo. Trayectoria 1 - marcadores de peso molecular, trayectoria 2-1 µg de CRM197 estándar, trayectoria 3-0,5 µg de CRM197 estándar, trayectoria 4-0,25 µg de CRM197 estándar, trayectorias 5-11, sobrenadantes de fermentaciones de C. diphtheriae. El Gel A muestra los sobrenadantes de CDT082 en trayectoria 5, CDT198 en trayectorias 6-8 (el sobrenadante se retiró a 22,5 horas para trayectoria 6, 24 horas para trayectoria 7 y 28 horas para trayectoria...

1. Un procedimiento de fermentación que comprende una etapa de fermentación de crecimiento de una cepa de Corynebacterium diphtheria en un medio en un fermentador en condiciones de agitación suficiente para mantener un cultivo homogéneo y aireación limitada de manera que la pO2 dentro del cultivo descienda a menos del 4% para la mayoría de la etapa de fermentación en el que la etapa de fermentación tiene lugar en a) un fermentador de 100 a 250 litros a un KLa de 30 a 60 h-1 o b) en un fermentador de 250 a 800 litros a un KLa de 60-150 h-1.

2. El procedimiento de fermentación según la reivindicación 1 en el que la pO2 desciende aproximadamente a cero durante la mayoría de la etapa de fermentación.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2 en el que la pO2 de menos del 4% se mantiene desde el momento en que la Corynebacterium diphtheria se ha desarrollado hasta una densidad suficiente para que la pO2 descienda a menos del 4% debido al rápido consumo de oxígeno, hasta que se completa la etapa de fermentación.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que la etapa de fermentación se efectúa a KLa constante.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la etapa de fermentación se efectúa a velocidad de agitación y tasa de aireación constantes.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que la etapa de fermentación se efectúa en condiciones variables de kLa.

7. El procedimiento según las reivindicaciones 1 a 6 en el que la etapa de fermentación tiene lugar con un flujo de aire de aire comprimido de 15 a 25 Umin y una velocidad de agitación de 150 a 250 rpm.

8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el medio es CY, SOC o medio similar y el pH dentro del fermentador se encuentra entre 7,0 y 7,8 por el grado de aireación sin requerir la adición de ácido o base.

9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la cepa de Corynebacterium diphtheria produce toxina de la difteria o un mutante de la misma, en particular CRM197.

10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la cepa de Corynebacterium diphtheria es ATCC39255.

11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el medio contiene entre 10 y 4.000 ppb de hierro.

12. Un procedimiento para fabricación de una preparación de un antígeno de C. diphtheriae que comprende las etapas de efectuar el procedimiento de fermentación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y aislar el antígeno de C. diphtheriae a partir del cultivo.

13. El procedimiento según la reivindicación 12 en el que el antígeno de C. diphtheriae es toxina de la difteria o un fragmento o un mutante de la misma (por ejemplo CRM197).

14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12 que comprende una etapa de adición de uno o más antígenos adicionales al antígeno de C. diphtheriae.

15. El procedimiento según la reivindicación 14 que comprende además una etapa de conjugación de la toxina de la difteria o un fragmento o mutante de la misma para uno o más antígenos adicionales.