Procedimiento para ensayar la seguridad viral de una composición de factor VIII de origen plasmático obtenida mediante filtración nanométrica,

que comprende una etapa que consiste en la determinación de la proporción residual de FvW de alta multimerización

Factor VIII viralmente seguro con bajo contenido en multímeros superiores.

La presente solicitud se refiere a una composición de Factor VIII de origen plasmático viralmente segura, obtenida después de una filtración nanométrica, que comprende Factor von Willebrand (FvW) con una proporción inferior o igual al 15% en decámeros y multímeros superiores. Dichas composiciones presentan un factor de reducción del título de los virus superior a 4 log y están por lo tanto adaptadas para el tratamiento de la hemofilia.

La disponibilidad en factor de coagulación es desde hace un cierto tiempo un problema de salud pública. Para responder a la demanda, los industriales han desarrollado unas técnicas de producción de factores recombinantes que se pensaba podrían reemplazar en la futura fabricación a partir de una reserva de plasma. Sin embargo, las cantidades producidas son todavía insatisfactorias y las inversiones para el desarrollo de estos productos son consecuentes. Por otra parte, se ha observado en los pacientes una reacción inmunitaria contra estos factores recombinantes, lo que implica la administración de dosis elevadas para alcanzar el efecto terapéutico deseado. Por último, algunos pacientes no toleran los factores recombinantes.

De esta manera, la producción de factores de coagulación de origen plasmático sigue siendo un reto importante.

El factor VIII o factor antihemofílico es una proteína plasmática que está presente en baja concentración en el plasma humano. Este factor cataliza las reacciones bioquímicas de la coagulación de la sangre mediante el aumento de la velocidad de reacción para desembocar en la formación de un coágulo de fibrina hemostática obtenido a partir del fibrinógeno soluble sometido a la acción de la trombina en presencia de calcio. El factor VIII interviene en la cascada de reacciones que desembocan en la trombinoformación que es la actividad enzimática responsable de la transformación del fibrinógeno en fibrina. El punto central de la coagulación descansa por lo tanto en la presencia y la activación del FVIII.

Los individuos hemofílicos, deficientes para el FVIII, son tratados mediante la inyección de estos FVIII purificados obtenidos o bien por recombinación genética, o bien por extracción del plasma humano.

En este último caso, se deben aplicar unos procedimientos de inactivación y/o de eliminación de virus con el fin de proteger los hemofílicos tratados mediante estos concentrados de cualquier infección debida a unos virus transmisibles por la sangre o sus derivados: virus de las hepatitis A, B, C, VIH o parvovirus B19...

Así, uno de los problemas esenciales seleccionados con la preparación del factor VIII a partir del plasma, reside en la necesidad de inactivar y/o de eliminar unos virus originalmente contenidos en la sangre al mínimo según las normas reglamentarias conservando al mismo tiempo un rendimiento óptimo en factor al final del procedimiento. Así se han desarrollado numerosas técnicas de inactivación viral tales como el calentamiento en seco, la pasteurización, el tratamiento solvente-detergente. El conjunto de estas técnicas es relativamente eficaz con respecto a unos virus recubiertos pero la inactivación o la eliminación de virus desnudos, en particular los pequeños virus tales como el parvovirus B19 o el virus de la hepatitis A, constituye un obstáculo principal.

Unas tecnologías más recientes utilizan las capacidades de retención viral de membranas con poros de pequeño tamaño. Efectivamente, estas tecnologías presentan una eficacia notable con respecto a virus de pequeño tamaño tales como los parvovirus B19 o el virus de la hepatitis A y se pueden aplicar a unas proteínas de pequeño peso molecular. Sin embargo, los umbrales de corte utilizados, que son inferiores a 900 kD, no permiten prever la filtración de proteínas o complejos proteicos de gran peso molecular como el factor VIII sin pérdidas notables de rendimiento.

El factor VIII se presenta como una organización proteica compleja de una proteína activa, el FVIII, transportada por una proteína de gran peso molecular a la que el FVIII está asociado mediante unos enlaces iónicos e hidrófobos. La proteína de gran peso molecular es el Factor von Willebrand (FvW) constituido por un conjunto de monómeros elementales que tienen un grado de multimerización variable que conduce a unas estructuras ensambladas en tetrámeros hasta unas organizaciones que comprenden más de dieciséis monómeros.

Según los métodos de purificación del FVIII empleados, el producto final puede contener FvW con diversos grados de multimerización (METZNER, HERMENTIN et al. -Haemophilia (1998), 4 (Supl.3), 25-32).

Ahora bien, en la patente FR 97 15888 del solicitante, se ha descrito que es posible filtrar el FVIII plasmático, pese a su tamaño, reteniendo a la vez unos virus de un tamaño superior o igual a 20 nm, en unos filtros de una porosidad aproximada de 15 nm con una concentración en iones caotrópicos de por lo menos 0,2 M.

Más recientemente, la investigación desarrollada para perfeccionar este procedimiento y escoger diferentes naturalezas de materiales filtrantes ha revelado que el tamaño de los poros del filtro y los límites técnicos pueden variar según los fabricantes. Así, parece necesario encontrar un ensayo rápido y reproducible que permita verificar que el producto final responde bien a las exigencias sanitarias.

La seguridad de la eliminación de los virus mediante filtros está garantizada por unos métodos de validación realizados sobre el filtro después del paso de la solución de FVIII. Estos métodos pueden ser, por ejemplo, la medición de la difusión gaseosa a través de la membrana o, en el caso de filtros en cuprofano, la medición del paso de partículas de oro coloidal calibradas a través del filtro.

Pero ningún método se refiere al propio producto filtrado para determinar que ha sido sometido a una filtración capaz de retener los virus en unas proporciones fijadas.

Se ha realizado un análisis más fino de la composición de los multímeros del FVIII antes y después de la filtración, al mismo tiempo que una medición de la reducción del título viral aportada por la filtración del factor VIII.

Se ha encontrado de forma sorprendente e inesperada que el empobrecimiento en multímeros de gran peso molecular de FvW medidos en los filtrados de FVIII está correlacionado con la eficacia de la retención de virus por el filtro. Además, se ha descubierto que es posible filtrar a aproximadamente 20 nm gracias a la verificación del contenido en multímeros. Por lo tanto, se propone un nuevo medio que permite la producción con un alto rendimiento y la caracterización del FVIII que responde a las exigencias de eliminación de virus mediante el filtro nanométrico.

Descripción

Así, en un primer aspecto, la presente solicitud se refiere a una composición farmacéutica de factor VIII de origen plasmático cuya seguridad viral corresponde a un factor de reducción superior a 4 log, lo que responde a las exigencias de seguridad en materia de eliminación de virus por filtración. La composición de FVIII asegurada de esta forma se caracteriza porque presenta una pequeña proporción residual de FvW de alta multimerización.

Más específicamente, la solicitud se refiere a una composición del factor VIII de origen plasmático, obtenida después de la filtración a través de un filtro nanométrico con una abertura nominal de poros de 15 pm 2 nm a 23 pm 2 nm, caracterizada porque comprende Factor von Willebrand (FvW) en una proporción inferior o igual a 15% en decámeros y multímeros superiores. En esta composición, el factor de reducción del título de un virus de un tamaño de 27 pm 3 nm es superior o igual a 4 log, preferentemente 5 log, ventajosamente 6 log comparado con la solución antes de la filtración.

Esta composición puede encontrarse en forma de una solución inyectable, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea.

La invención se refiere asimismo a la correlación existente entre la presencia de 15% como máximo de decámeros y multímeros superiores de FvW con un factor de reducción del título viral de por lo menos 4 log.

Así, en un segundo aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para ensayar la seguridad viral de una composición de Factor VIII de origen plasmático, comprendiendo dicho procedimiento una etapa que consiste en determinar la proporción residual de FvW de alta multimerización....

1. Procedimiento para ensayar la seguridad viral de una composición de factor VIII de origen plasmático obtenida mediante filtración nanométrica, que comprende una etapa que consiste en la determinación de la proporción residual de FvW de alta multimerización.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la detección de menos de 15% de decámeros y multímeros superiores de FvW después de la filtración nanométrica indica que dicha composición está viralmente segura.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la detección de menos de 15% de decámeros y multímeros superiores de FvW está correlacionada con un factor de reducción del título viral de por lo menos 4 log.

4. Procedimiento de preparación de una solución de factor VIII viralmente segura que comprende una etapa de filtración a través de los filtros nanométricos de abertura nominal de oros comprendida entre 15 pm 2 nm y 23 pm 2 nm, una etapa de dosificación del factor von Willebrand (FvW) de decámeros y multímeros superiores.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la etapa de dosificación consiste en una verificación de que la proporción de decámeros y multímeros superiores de FvW es inferior o igual a 15%.

6. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque una proporción de decámeros y multímeros superiores del FvW inferior o igual a 15 % indica que el factor de reducción del título de un virus de un tamaño de 27 pm 3 nm es superior o igual a 4 log, preferentemente 5 log ó 6 log.