Un aparato para la extracción de material de una glándula (70) de un gusano de seda de tipo salvaje o recombinante que comprende:

- un dispositivo de sujeción (50) en el que se sujeta al menos parte de la glándula (70);

- una disolución tampón (30) que baña la glándula (70) al menos parcialmente; en el que, durante el uso, se libera el material desde la glándula (70) a la disolución tampón (30); y

- un área (20) de recogida de material en la que se recoge el material

Procedimiento y aparato de extracción de la glándula de un artrópodo.

Campo de la invención

La solicitud se refiere a un aparato y un procedimiento para la extracción de material de glándulas de artrópodos de tipo salvaje o recombinante.

Técnica anterior

Inoue y col., en Eur. J. Biochem. 2004, 271, 356-366, describieron la secreción de fibroína de seda natural de Bombyx mori de la glándula posterior de la seda como una unidad elemental (que se denomina de aquí en adelante UE) de 2,3 MDa que está constituida por seis conjuntos de un heterodímero de fibroina de cadena pesada-cadena ligera unidas por disulfuro y una molécula de P25.

Actualmente, se elaboran disoluciones de proteínas de seda (tales como fibroína y otras proteínas) como disoluciones de seda regenerada sacada de capullos o filamentos de seda que se disuelven en agentes de solubilización (por ejemplo bromuro de litio) y se vuelven a plegar por medio de diálisis y otras técnicas de intercambio de tampón (véase, por ejemplo, Altmann y col., Biomaterials 2003, 24, 401-416). Dados los retos conocidos para producir proteínas activas por medio de replegado después de solubilización en agentes de plegado de proteína/caotrópicos (Vallejo and Rinas, Microbial Cell Factories, 2004, doi: 10.1186/1475-2859-3-11), una persona experta en la técnica apreciará las dificultades técnicas que se han resuelto para producir UE de fibroína nativa correctamente plegadas a partir de disoluciones de seda regenerada. Por lo tanto, no es sorprendente que no haya informe alguno hasta la fecha sobre la producción con éxito de fibroína de alto peso molecular ensamblada en conformación de UE a partir de disoluciones de seda regenerada.

Las diferencias entre las proteínas de seda nativas según se producen y se almacenan en las glándulas de artrópodos, tales como gusanos de seda (es decir en su conformación de UE de alto peso molecular) y las proteínas de seda regeneradas (anteriormente descritas) son tales que las proteínas de seda regeneradas producidas por las técnicas actuales tienen a lo sumo características "como-nativas", es decir, las proteínas de seda regeneradas tienen algunas propiedades en común, pero no se puede decir que sean idénticas ni sustancialmente idénticas a las proteínas de seda nativas. Las proteínas de seda nativas se definen como aquellas proteínas que se encuentran en su conformación de proteína nativa, es decir, con las estructuras de plegado primario, secundario, terciario y cuaternario similares o esencialmente similares a la proteína de tipo salvaje (Thomas E. Creighton, Proteins, Segunda Edición, 1993, 232-236, ISBN 0-7167-2317-4). Las diferencias de proteínas de seda regeneradas en su patrón de plegado de proteína, especialmente respecto a su plegado terciario y cuaternario en comparación con proteínas de seda nativas aparentemente no tienen impacto negativo en su uso como ingredientes cosméticos o farmacéuticos (según se describe, por ejemplo, por Tsubouchi y col., en la solicitud de patente internacional PCT/JP01/02250). Sin embargo, para aplicaciones más exigentes, tales como la producción de películas, revestimientos y objetos moldeados mecánicamente resistentes o el hilado biomimético de sedas (según se describe por Vollrath y Knight en la patente europea 1244828, transferida a Spintec Engineering GmbH), el plegado correcto y el autoensamblado de las proteínas de seda usadas para producción de dichos materiales desempeñan un papel en la determinación de la resistencia mecánica y características funcionales de los materiales formados. Debido a las diferencias entre las proteínas de seda regeneradas y las proteínas de seda nativas anteriormente destacadas, la calidad de las sedas regeneradas no ha sido suficiente para la producción de materiales de seda de alta calidad por medio de moldeo, revestimiento o hilado biomimético según se describe en la anteriormente mencionada patente europea 1244828.

La solicitud de patente europea Nº 1241178 (transferida al National Institute of Agrobiological Sciences and Kowa Co) enseña un procedimiento para la producción de fibroína de seda disolviendo capullos en una disolución acuosa alcalina o una disolución acuosa de urea. La disolución acuosa alcalina que se describe en los ejemplos de la solicitud de patente 1241178 es de carbonato de sodio o de tiocianato de litio a un pH de 7. Posteriormente, se añade acetona o alcohol a la disolución acuosa alcalina para precipitar la fibroína. Los resultados que se muestran en la solicitud de patente no indican que se produjeran proteínas de seda de alto peso molecular que exhibieran conformaciones de plegado de proteína nativa terciario y cuaternario.

La solicitud de patente 1241178 también reseña (párrafo 18) un procedimiento en el que se extrae la glándula de la seda del cuerpo de un gusano de seda a lo que sigue la extracción de la proteína del lumen de la glándula de la seda. Sin embargo, la descripción sugiere que el proceso no es adecuado para producción industrial porque la fibroína obtenida contiene impurezas tales como humor del gusano de seda y células de la glándula del gusano de seda.

Se ha descrito un procedimiento para la extracción de proteínas de seda nativas de glándulas de gusano de seda en la solicitud de patente internacional Nº PCT/EP02/12033 y la correspondiente patente de EE.UU. Nº 7.041.797 (Vollrath, transferida a Spintec Engineering GmbH). La patente 7.041.797 describe una aproximación en la que las glándulas de seda se retiran del cuerpo del gusano de seda a lo que sigue la retirada de una capa epitelial de las glándulas de seda. El procedimiento funciona bien para la extracción manual a partir de glándulas de seda individuales. Sin embargo, es tedioso y lleva mucho tiempo cuando se necesita extraer un gran número de glándulas de seda. Así pues, es impracticable como procedimiento de producción de las proteínas nativas a partir de glándulas de seda a escala industrial. El inventor de la patente 7.041.797 tampoco ha detallado un procedimiento ni un aparato que permita mezclado y agrupación eficientes y homogéneos de proteínas extraídas de las glándulas de seda ni tampoco la incorporación de aditivos en el contenido glandular extraído de seda.

De modo similar, la solicitud de patente japonesa JP-A-2268693 (Asahi) enseña un procedimiento para cultivar una glándula de seda obtenida de gusanos de seda (tal como la de Bombyx mori) y usar un medio de cultivo. El medio de cultivo se retira usando diálisis para obtener una disolución acuosa de la fibroína de seda. Sin embargo, los inventores de la solicitud de patente 2268693 no consideraron cómo se incorporan homogéneamente aditivos al contenido altamente viscoso de la glándula de seda.

Un procedimiento más rudimentario para obtener proteína de fibroína se describe en la solicitud de patente japonesa JP-A-3209399 (Terumo) en el que se cortan las cabezas de los gusanos de seda. A continuación se recolecta la proteína de fibroína presionando el abdomen del gusano de seda para extraer la proteína de fibroína. Se retira sericina de la mezcla de proteína resultante tratando la mezcla proteínica con un álcali débil, tal como Na₂CO₃. Los inventores de la solicitud de patente 3209399 no enseñaron cómo se incluyen aditivos en las mezclas proteínicas. Además, el procedimiento de la solicitud de patente 3209399 tiene la desventaja de que no se evita fácilmente la incorporación de impurezas del cuerpo del gusano de seda. Estas impurezas se tienen que retirar o puede que afecten a las propiedades de las fibras hiladas biomiméticamente de objetos hilados, revestidos o moldeados que se producen con dichas mezclas de proteínas.

La solicitud de patente japonesa JP-A-046525 (Best Kobo KK and Okamoto Resu KK) describe un procedimiento para la extracción de sericina. La sericina se extrae sumergiendo seda bruta en agua con electrolitos. La solicitud de patente 046525 no describe aparato ni procedimiento para la extracción de material de una glándula de un gusano de seda de tipo salvaje o recombinante.

Resumen de la invención

Por lo tanto, se necesita un procedimiento y un aparato para extraer material de una glándula de un gusano de seda de tipo salvaje o recombinante; el material puede ser una proteína, un péptido y combinaciones de proteínas y péptidos.

Se necesita adicionalmente incorporar aditivos a dicho material glandular del gusano de seda de tipo salvaje o recombinante.

Se necesita adicionalmente mezclar homogéneamente el material extraído de más de una glándula del gusano de...

1. Un aparato para la extracción de material de una glándula (70) de un gusano de seda de tipo salvaje o recombinante que comprende:

2. El aparato de la reivindicación 1, que incorpora adicionalmente un soporte (60).

3. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se sedimenta el material dentro del aparato.

4. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incorpora adicionalmente un dispositivo (80) de captación-y-colocación.

5. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la disolución tampón tiene uno o más aditivos (40).

6. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que el soporte (60) es movible dentro del aparato.

7. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que el soporte (60) es no poroso.

8. El aparato de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dispositivo de sujeción (50) es movible dentro del aparato.

9. Un procedimiento para la extracción de material de una glándula (70) de un gusano de seda de tipo salvaje o recombinante que comprende:

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el material se selecciona entre el grupo constituido por proteínas, péptidos y combinaciones de los mismos.

11. El procedimiento de la reivindicación 9 ó la 10, en el que el material es fibroína.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el gusano de seda puede ser cualquier especie nativa o recombinante de la familia Bombycidae.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, que adicionalmente comprende añadir al menos un aditivo (40) a la disolución tampón.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que al menos un aditivo (40) es una molécula biológicamente activa.

15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, que adicionalmente comprende un ajuste de la distancia entre el dispositivo de sujeción (50) y/o un soporte (60) y un área (20) de recogida de material.

16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, que adicionalmente comprende hacer que pase el material liberado a través del soporte (60).

17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, que adicionalmente comprende un ajuste de la distancia entre el soporte (60) y un área (20) de recogida de material.

18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, en el que proporcionar la glándula (70) comprende la retirada de la glándula (70) del cuerpo del gusano de seda.