Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína VPH 52 L1 tal como se representa en la SEC ID N:

2, comprendiendo el ácido nucleico una secuencia de nucleótidos tal como se representa en la SEC ID Nº:1

Expresión optimizada del VPH 52 L1 en levadura.

Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a la prevención y/o el tratamiento de la infección por el virus del papiloma humano (VPH). De modo más específico, la presente invención se refiere a polinucleótidos sintéticos que codifican proteínas VPH 52 L1, y a vectores recombinantes y huéspedes que comprenden dichos polinucleótidos. Esta invención se refiere también partículas similares a virus (VLP) del VPH 52, produciéndose las VLP por expresión recombinante del VPH 52 L1 o L1 + L2 en células de levadura y a su uso en vacunas y composiciones farmacéuticas para prevenir y tratar infecciones por VPH.

Antecedentes de la invención

Existen más de 80 tipos del virus del papiloma humano (VPH), muchos de los cuales se han asociado con una amplia variedad de fenotipos biológicos, desde verrugas benignas proliferativas hasta carcinomas malignos (para una revisión, véase McMurray y col., Int. J. Exp. Pathol. 82(1): 15-33 (2001)). El VPH6 y el VPH11 son los tipos más comúnmente asociados con verrugas benignas, condilomas acuminados no malignos y/o displasia de grado bajo de la mucosa genital o respiratoria. El VPH 16 y el VPH 18 son los tipos de riesgo alto más frecuentemente asociados con carcinomas in situ e invasivos del cuello uterino, vagina, vulva y conducto anal. Más del 90% de los carcinomas del cuello uterino están asociados con infecciones por el VPH16, el VPH18 o por los tipos oncogénicos menos prevalentes VPH31, -33, -45, -52 y -58 (Schiffman y col., J. Natl. Cancer Inst. 85(12): 958-64 (1993)). La observación de que el ADN del VPH se detecta en el 90-100% de los cánceres de cuello uterino proporciona una evidencia epidemiológica sólida de que los VPH causan carcinoma de cuello uterino (véase Bosch y col., J. Clin. Pathol. 55: 244-265 (2002)).

Los virus del papiloma son virus pequeños (50-60 nm), sin envoltura, de ADN icosaédrico, que codifican hasta ocho genes tempranos y dos genes tardíos. Las fases de lectura abierta (ORF) de los genomas víricos se designan E1 a E7, y L1 y L2, donde "E" denota temprano y "L" denota tardío. L1 y L2 codifican proteínas de la cápside vírica, mientras que los genes E están asociados con funciones tales como la replicación vírica y la transformación celular.

La proteína L1 es la proteína principal de la cápside y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La proteína L2 es la proteína secundaria de la cápside. Los datos inmunológicos sugieren que la mayor parte de la proteína L2 es interna a la proteína L1 en la cápside vírica. Tanto las proteínas L1 como las L2 se mantienen en gran medida entre los diferentes virus del papiloma.

La expresión de la proteína L1 o de una combinación de las proteínas L1 y L2 en levadura, células de insectos o bacterias conduce al autoensamblaje de partículas similares a virus (VLP) (para una revisión, véase Schiller y Roden, en Papillomavirus Reviews: Current Research on Papillomaviruses; Lacey, ed. Leeds, Reino Unido: Leeds Medical Information, páginas 101-12 (1996)). Las VLP son similares morfológicamente a viriones auténticos y son capaces de inducir valoraciones altas de neutralización de anticuerpos tras administración en animales o seres humanos. Debido a que las VLP no contienen el genoma vírico potencialmente oncogénico, presentan una alternativa segura al uso de virus vivos en el desarrollo de vacunas del VPH (para una revisión, véase Schiller y Hidesheim, J. Clin. Virol. 19: 67-74 (2000)). Por esta razón, los genes L1 y L2 han sido identificados como dianas inmunológicas para desarrollar vacunas profilácticas y terapéuticas contra la infección y la enfermedad por VPH.

El desarrollo y la comercialización de la vacuna del VPH se han visto obstaculizados por dificultades asociadas con la obtención de niveles de expresión altos de proteínas de la cápside en organismos huéspedes transformados con éxito, limitando la producción de proteína purificada. Por lo tanto, a pesar de la identificación de secuencias de nucleótidos de tipo silvestre que codifican proteínas VPH L1 tales como la proteína VPH 52 L1, sería muy deseable desarrollar una fuente de proteína VPH L1 bruta fácilmente renovable que utilice secuencias de nucleótidos que codifiquen la VPH 52 L1 que estén optimizadas para la expresión en la célula huésped deseada. Adicionalmente, sería útil producir grandes cantidades de VLP del VPH 52 L1 que tengan las propiedades que confieren inmunidad de las proteínas nativas para usar en el desarrollo de vacunas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a composiciones y a procedimientos para facilitar inmunidad, o potenciarla, en los productos proteicos expresados por genes VPH 52 L1. Específicamente, la presente invención proporciona polinucleótidos que codifican proteínas VPH 52 L1, estando los polinucleótidos optimizados con codones para una expresión de nivel elevado en una célula de levadura. En una realización alternativa de la invención, la secuencia de nucleótidos del polinucleótido está modificada para eliminar las señales de terminación de la transcripción reconocidas por la levadura. La presente invención proporciona, además, partículas similares a virus (VLP) del VPH 52, produciéndose dichas VLP por expresión recombinante del VPH 52 L1 o L1 + L2 en células de levadura, y desvela el uso de VLP del VPH 52 en composiciones inmunogénicas y vacunas para la prevención y/o el tratamiento de enfermedad por el VPH y cáncer asociado al VPH.

La presente invención se refiere a moléculas sintéticas de ADN que codifican proteínas VPH 52 L1. Los codones de las moléculas sintéticas están diseñados para usar los codones preferentes de una célula de levadura. En una realización alternativa de la invención, la secuencia de nucleótidos de la molécula sintética está modificada para eliminar las señales de terminación de la transcripción reconocidas por la levadura. Las moléculas sintéticas pueden usarse como fuente de proteínas VPH 52 L1 que pueden autoensamblarse en VLP. Dichas VLP pueden usarse en una vacuna basada en VLP.

Una realización ejemplar de la presente invención comprende una molécula sintética de ácido nucleico que codifica la proteína VPH 52 L1 tal como se representa en la SEC ID Nº:2, comprendiendo dicha molécula de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos que está optimizada con codones para la expresión a alto nivel en una célula de levadura.

También se proporcionan vectores recombinantes y células huésped recombinantes, tanto procariotas como eucariotas, que contienen las moléculas de ácido nucleico desveladas a lo largo de la presente memoria descriptiva. En una realización preferente de la presente invención, la célula huésped es una célula de levadura.

La presente invención también comprende un procedimiento para expresar una proteína VPH 52 L1 en una célula recombinante, que comprende: (a) introducir un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína VPH 52 L1 en una célula huésped de levadura; y (b) cultivar la célula huésped de levadura en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína VPH 52 L1.

La presente invención se refiere, además, a un procedimiento para expresar una proteína VPH 52 L1 en una célula huésped recombinante, que comprende: (a) introducir un vector que comprende una molécula de ácido nucleico en una proteína VPH 52 L1 en una célula huésped de levadura, estando la molécula de ácido nucleico optimizada con codones para la expresión óptima en la célula huésped de levadura y; (b) cultivar la célula huésped de levadura en condiciones que permitan la expresión de dicha proteína VPH 52 L1.

En realizaciones preferentes, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos tal como se exponen en SEC ID Nº:1 (denominada en el presente documento "secuencia 52 L1 R").

La presente invención se refiere también a partículas similares a virus (VLP) del VPH 52 que se producen en células de levadura, a procedimientos para producir VLP del VPH 52 y a procedimiento de uso de VLP del VPH 52.

En una realización preferente de la invención, la levadura se selecciona del grupo constituido por: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragilis, Kluveromyces lactis y Schizosaccharomyces pombe.

Otro aspecto de la presente invención es una VLP del VPH 52, en el que la VLP se produce por expresión recombinante del VPH 52 L1 o el VPH 52 L1 + L2 en una célula...

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína VPH 52 L1 tal como se representa en la SEC ID N:2, comprendiendo el ácido nucleico una secuencia de nucleótidos tal como se representa en la SEC ID Nº:1.

2. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 2.

4. La célula huésped de la reivindicación 3, siendo la célula huésped una célula de levadura.

5. La célula huésped de la reivindicación 4, estando seleccionada la célula huésped del grupo constituido por: Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyvermyces fragilis, Kluveromyces lactis y Schizosaccharomyces pombe.

6. La célula huésped de la reivindicación 4, siendo la célula huésped Saccharomyces cerevisiae.

7. Un procedimiento para producir partículas similares a virus (VLP) del VPH 52 L1, que comprende:

a) transformar la levadura con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1;

b) cultivar la levadura transformada en condiciones que permiten la expresión de la molécula de ácido nucleico para producir una proteína recombinante de virus del papiloma; y

c) aislar la proteína recombinante de virus del papiloma para producir VLP del VPH 52 L1.

8. Un procedimiento para preparar una vacuna para el tratamiento o la prevención de cáncer de cuello uterino asociado al VPH, comprendiendo dicho procedimiento la producción de VLP de VPH 52 L1 por el procedimiento de la reivindicación 7.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, comprendiendo la vacuna además VLP de al menos un tipo adicional de VPH.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, estando seleccionado el al menos un tipo adicional de VPH del grupo constituido por: VPH6, VPH11, VPH 16, VPH 18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH39, VPH45, VPH51, VPH55, VPH56, VPH58, VPH59 y VPH68.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, comprendiendo el al menos un tipo de VPH VPH 16.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, comprendiendo la vacuna además VLP del VPH18.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, comprendiendo la vacuna además VLP del VPH6 y VLP del VPH11.

14. El procedimiento de la reivindicación 12 ó 13, comprendiendo la vacuna además VLP del VPH31.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, comprendiendo la vacuna además VLP del VPH45.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, comprendiendo la vacuna además VLP del VPH58.