ENSAYOS DE INTERACTIVIDAD MOLECULAR O SUBCELULAR USANDO DESPOLARIZACION TRAS TRANSFERENCIA DE ENERGIA DE RESONANCIA (DARET).

Un procedimiento basado en DARET (despolarización tras transferencia de energía de resonancia) para determinar la proximidad de dos o más características moleculares,

que son regiones moleculares o celulares, en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

a) poner en contacto en dicha muestra, una primera característica molecular marcada con un fluoróforo donador que tiene un primer espectro de absorción y un primer espectro de emisión, y una segunda característica molecular marcada con un fluoróforo aceptor que tiene un segundo espectro de absorción que se superpone con el primer espectro de emisión y un segundo espectro de emisión;

b) irradiar dicha muestra con luz plana polarizada a una longitud de onda dentro de dicho primer espectro de absorción;

c) detectar la polarización de fluorescencia de la muestra a una longitud de onda dentro de dicho segundo espectro de emisión; y

d) correlacionar un cambio en la transferencia de energía y en la polarización con un cambio en la proximidad de la primera y la segunda características moleculares entre ellas en el transcurso del tiempo o con relación a un control,

en el que una disminución en la transferencia de energía y un aumento en la polarización en el transcurso del tiempo o con relación a un control indican que la distancia entre la primera y la segunda característica ha aumentado, mientras que un aumento en la transferencia de energía y una disminución en la polarización en el transcurso del tiempo o con relación a un control indican que la distancia entre la primera y la segunda característica ha disminuido

Ensayos de interactividad molecular o subcelular usando despolarización tras transferencia de energía de resonancia (DARET).

La presente solicitud reivindica prioridad a tenor del Código de los Estados Unidos 35 § 119(e) a la Solicitud de Estados Unidos 11/548.411 presentada el 11 de octubre de 2006, publicada como US 2007/0275477.

La presente invención se refiere en general a ensayos para detectar la interacción física (o la falta de interacción física) entre moléculas o partes de la misma molécula. Además, el presente ensayo es aplicable para detectar interacciones entre, por ejemplo, las características subcelulares tales como, sin limitación, la membrana plasmática, las mitocondrias, el aparato de Golgi, las vesículas, y similares usando la nueva técnica óptica llamada despolarización tras transferencia de energía de resonancia (DARET).

Tales ensayos pueden ser muy útiles en las aplicaciones que incluyen la medición o la detección de interacciones ligando:receptor, determinados ensayos enzimáticos (tales como ensayos de proteasas), la detección de la circulación molecular intracelular y en la detección de interacciones proteína:proteína, ácido nucleico:ácido nucleico y proteína:ácido nucleico.

La posición de las moléculas dentro de una célula puede sugerir algo con respecto a su función. Las proteínas que pasan del citoplasma al núcleo cuando la célula se expone a una hormona o a un factor de crecimiento pueden estar implicadas en la expresión genética. Como alternativa, las moléculas que son transportadas a la membrana celular en respuesta a un estímulo pueden ser, por ejemplo, moléculas secretoras implicadas en las señales célula-célula, los neurotransmisores que se producen dentro las neuronas se almacenan para el uso posterior antes de responder a un cambio transitorio en el potencial de membrana siendo secretados en la hendidura sináptica. Es útil para controlar la posición de tales moléculas con respecto a características celulares tales como, por ejemplo, el aparato de Golgi, la membrana celular y los lisosomas.

Por otra parte, los ensayos para la detección de interactividad entre moléculas pueden tener aplicabilidad clara para los esfuerzos en el descubrimiento de fármacos. Por ejemplo, la construcción de bibliotecas de compuestos que contienen cientos de miles de compuestos o más se ha convertido actualmente en algo común; sin embargo, la capacidad para cribar bibliotecas tan grandes de compuestos es un cuello de botella común para desarrollar un fármaco. Los presentes procedimientos proporcionan ensayos fáciles y rápidos, por ejemplo, unión y/o actividad de fármacos, que pueden realizarse en tiempo real, sin el uso de reactivos radiantes o tóxicos. Los presentes procedimientos son también adaptables para el uso en formatos de selección de alto rendimiento, que permitan la automatización de diversas etapas del ensayo.

La construcción y el cribado de grandes bibliotecas de compuestos es un avance práctico relativamente reciente en el desarrollo de fármacos, coincidiendo con el desarrollo de la cloNaClón molecular precisa y las técnicas de ingeniería genética que permiten la construcción de moléculas diana clonadas, en particular proteínas. Las proteínas son por lo general el resultado de la manipulación genética, con frecuencia como resultado de la expresión de una construcción de un vector introducido en una célula huésped. Las moléculas diana pueden purificarse parcialmente y algunas veces se utilizan en un sistema de ensayo completamente in vitro. Como alternativa, algunas veces la célula huésped que expresa la molécula diana se usa en cultivo como parte del sistema de ensayo.

Antes de la llegada del cribado de alto rendimiento, los ensayos de selección de fármacos eran con frecuencia el resultado de la investigación académica desarrollada con un énfasis en la investigación biológica básica más que en el gran volumen. Estos ensayos demandaban frecuentemente mucho tiempo y trabajo, y típicamente implicaban el uso de radionúclidos, con los riesgos acompañantes para la salud del personal del laboratorio asociado con los mismos. Por lo tanto, los sistemas de ensayo utilizados como base para los primeros esfuerzos diseñados racionalmente para el descubrimiento de fármacos eran derivados de estos ensayos, y se convirtieron en una etapa limitante de la velocidad en la identificación rápida de los compuestos potencialmente útiles para una aplicación terapéutica dada.

Típicamente, los procedimientos de ensayo han estado basados en procedimientos de ensayo denominados heterogéneos. En la mayoría de los ensayos, estos dan como resultado una mezcla de compuestos sin reaccionar o no unidos (tales como, sin limitación, un sustrato enzimático o ligando del receptor) y componentes que reaccionaron o unidos, (por ejemplo un producto enzimático o un receptor-ligando unido). Con frecuencia, uno o más de estos componentes se marcan con un marcador detectable. En un "ensayo heterogéneo" esta mezcla se resuelve (y por lo general debe resolverse) por separación física del material marcado que ha reaccionado, se ha modificado, o unido del marcador restante antes de que puedan obtenerse datos útiles. Por ejemplo, si el ensayo es un ensayo de unión, la fijación del receptor a unir por un ligando a un soporte sólido, tal como perlas magnéticas, permite el lavado de las perlas después de la reacción. El marcador asociado con las perlas lavadas puede entonces detectarse como indicación de la interacción o de la actividad deseada.

En contraste, los procedimientos de ensayo en los que la detección del material marcado que ha reaccionado, se ha modificado, o unido puede hacerse sin la necesidad de una etapa de separación se denominan sistemas de ensayo "homogéneos". Puede encontrarse una ilustración de un sistema homogéneo de detección de ácidos nucleicos en, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 5.639.604 con el título "Homogeneous Protection Assay".

Ésta y todas las otras publicaciones citadas en esta solicitud de patente se incorporan en el presente documento por referencia como parte de la presente solicitud de patente a menos que se indique expresamente de otra manera.

Más recientemente, en particular tras el desarrollo de las proteínas de fusión fabricadas con precisión que incorporan restos fluorescentes tales como la proteína fluorescente verde (GFP) y sus derivados de otros colores, el uso de la fluorescencia se ha convertido en una elección cada vez más popular en la investigación y el desarrollo de la biología. Los fluoróforos pueden ser moléculas orgánicas más pequeñas tales como los colorantes fluorescentes o moléculas más grandes tales como los polipéptidos fluorescentes. Aunque no todos los procedimientos de fluorescencia son aptos para el cribado de alto rendimiento, se ha descrito una serie de procedimientos en la bibliografía. Por ejemplo, Eggeling y col., 8: 632 Drug Discovery Today (julio de 2003) describen técnicas que incluyen fluorescencia total, fluorescencia dependiente del tiempo, polarización de fluorescencia, tiempo de vida de la fluorescencia, o anisotropía resuelta por tiempo, que son aptos para el cribado de alto rendimiento.

La fluorescencia total se usa frecuente para detectar la actividad enzimática en los ensayos diseñados de manera tal que el sustrato (o el producto) se vuelve fluorescente (o se extingue la fluorescencia) tras la modificación enzimática del sustrato. Para los objetivos de la presente solicitud de patente, el término "fluorescencia" significa la emisión de radiación electromagnética, especialmente de luz visible, estimulada en una sustancia por la absorción de radiación incidente, e incluye específicamente la luminiscencia. La fluorescencia dependiente del tiempo utiliza fluoróforos que tienen tiempos de vida de fluorescencia largos (tales como los quelatos de lantánido) para distinguir su fluorescencia de la fluorescencia de vida más corta. Esto se ha usado según se informa en combiNaClón con la transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia (FRET), que implica la transferencia no radiante de energías desde un donador a una molécula aceptora. La polarización de fluorescencia es una técnica que implica la detección de cambios en la polarización que surgen de las diferencias en el volumen molar de los reactivos y los productos.

Además, el uso de dispositivos tales como los láseres de alta energía para la excitación y la microscopía confocal ha permitido que la excitación y la detección de luz emitida puedan controlarse mucho más fácilmente hoy que nunca antes. Por...

1. Un procedimiento basado en DARET (despolarización tras transferencia de energía de resonancia) para determinar la proximidad de dos o más características moleculares, que son regiones moleculares o celulares, en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

en el que una disminución en la transferencia de energía y un aumento en la polarización en el transcurso del tiempo o con relación a un control indican que la distancia entre la primera y la segunda característica ha aumentado, mientras que un aumento en la transferencia de energía y una disminución en la polarización en el transcurso del tiempo o con relación a un control indican que la distancia entre la primera y la segunda característica ha disminuido.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicha primera y segunda características moleculares están comprendidas en la misma molécula.

3. El procedimiento de la reivindicación 2 en el que dicha molécula comprende una secuencia de aminoácidos.

4. El procedimiento de la reivindicación 3 en el que dicha primera característica molecular está comprendida en una mitad amino terminal de dicha secuencia de aminoácidos.

5. El procedimiento de la reivindicación 3 en el que dicha primera característica molecular está comprendida en una mitad carboxilo terminal de dicha secuencia de aminoácidos.

6. El procedimiento de la reivindicación 3 en el que al menos uno de dichos fluoróforo donador y aceptor comprende un polipéptido unido a dicha molécula.

7. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que al menos uno de dichos fluoróforo donador o aceptor está unido a dicha molécula por un enlace peptídico.

8. El procedimiento de la reivindicación 6 en el que al menos un fluoróforo se selecciona del grupo constituido por una proteína fluorescente verde, una proteína fluorescente azul, una proteína fluorescente roja, una proteína fluorescente cian, una proteína fluorescente amarilla, un péptido tetracisteína que interactúa fuertemente con un fluoróforo, un polipéptido AGT que interactúa fuertemente con un fluoróforo, un polipéptido dehalogenasa que interactúa fuertemente con un fluoróforo, un colorante fluorescente violeta, un colorante fluorescente azul, un colorante fluorescente cian, un colorante fluorescente verde, un colorante fluorescente amarillo verdoso, un colorante fluorescente amarillo, un colorante fluorescente naranja, un colorante fluorescente rojo anaranjado, un colorante fluorescente rojo, un colorante fluorescente rojo extremo o un colorante fluorescente infrarrojo, o, un fluoróforo aceptor es un colorante fluorescente violeta, un colorante fluorescente azul, un colorante fluorescente cian, un colorante fluorescente verde, un colorante fluorescente amarillo verdoso, un colorante fluorescente amarillo, un colorante fluorescente naranja, un colorante fluorescente rojo anaranjado, un colorante fluorescente rojo, un colorante fluorescente rojo extremo o un colorante fluorescente infrarrojo.

9. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dichas primera y segunda características moleculares están contenidas en el mismo polipéptido, y están separadas por un sitio de escisión de proteasas susceptible a enzimas.

10. El procedimiento de la reivindicación 9 en el que sitio de escisión de proteasas comprende un sitio de escisión de tripsina, un sitio de escisión de quimotripsina y un sitio de escisión de endopeptidasa de toxina botulínica.

11. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicha primera característica molecular y dicha segunda característica molecular son dominios de polipéptidos.

12. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dichas primera y segunda características moleculares están situadas en una única molécula de sustrato, separadas por una diana escindible.

13. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que la diana escindible comprende un dominio de polipéptido.

14. El procedimiento de la reivindicación 11 en el que el dominio de polipéptido es escindible por una enzima selectiva.