DETECCION DE OLIGOMERIZACION DE RECEPTOR.

Método de detección de dímeros de analitos asociados a membrana en una membrana celular,

comprendiendo el método las etapas de:

proporcionar un compuesto de unión específico para un primer analito asociado a membrana de un dímero, comprendiendo el dímero el primer analito asociado a membrana y un segundo analito unido a membrana, y teniendo el compuesto de unión uno o más marcadores moleculares cada uno unido al mismo mediante un enlace escindible, teniendo cada uno del uno o más marcadores moleculares una característica de separación;

proporcionar una sonda de escisión específica para el segundo analito unido a membrana, teniendo la sonda de escisión un resto que induce la escisión con una proximidad eficaz;

mezclar la sonda de escisión, el compuesto de unión y la membrana celular de modo que la sonda de escisión se une específicamente al primer analito asociado a membrana y el compuesto de unión se une específicamente al segundo analito asociado a membrana y de modo que los enlaces escindibles del compuesto de unión están dentro de la proximidad eficaz del resto que induce la escisión de manera que se liberan los marcadores moleculares; y

separar e identificar los marcadores moleculares liberados para determinar la presencia o ausencia o la cantidad de dímero en la membrana celular, en el que dicho primer analito asociado a membrana y dicho segundo analito asociado a membrana son cada uno receptores del factor de crecimiento epidérmico en dicha membrana celular

Detección de oligomerización de receptor.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para medir la oligomerización de moléculas de superficie celular, particularmente receptores de membrana de superficie celular.

Antecedentes de la invención

Las interacciones de componentes de membrana de superficie celular desempeñan papeles cruciales en la transmisión de señales extracelulares a una célula en la fisiología normal, y en estados patológicos. En particular, muchos tipos de receptores de superficie celular experimentan dimerización u oligomerización en relación con la transducción de una señal o un acontecimiento extracelular, por ejemplo la unión ligando-receptor, en una respuesta celular, tal como la proliferación, aumento o disminución de la expresión génica o similar, por ejemplo George et al, Nature Reviews Drug Discovery, 1: 808-820 (2002); Mellado et al, Ann. Rev. Immunol., 19: 397-421 (2001); Schlessinger, Cell, 103: 211-225 (2000); Yarden, Eur. J. Cancer, 37: S3-S8 (2001). El papel de tales acontecimientos de transducción de señales en enfermedades, tales como el cáncer, ha sido el objeto de investigación intensa y ha conducido al desarrollo de varios nuevos fármacos y candidatos a fármaco, por ejemplo Herbst y Shin, Cancer, 94: 1593-1611 (2002); Yarden y Sliwkowski, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2: 127-137 (2001).

Se ha usado una amplia variedad de técnicas para estudiar la dimerización y oligomerización de receptores de superficie celular, incluyendo inmunoprecipitación, reticulación química, transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET), transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) y similares, por ejemplo Price et al, Methods in Molecular Biology, 218: 255-267 (2003); McVey et al, J. Biol. Chem, 17: 14092-14099 (2001); Salim et al, J. Biol. Chem., 277: 15482-15485 (2002); Angers et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 3684-3689 (2000). Además, Rios et al., en Pharmacology & Therapeutics, 92: 71-87, (2001), proporcionan un resumen de técnicas farmacológicas, bioquímicas y biofísicas con el fin de estudiar receptores de proteínas G y su regulación y función por medio de oligomerización. Desafortunadamente, a pesar de la importancia de la dimerización y oligomerización de receptores en procesos de transducción de señales, las técnicas para medir tales interacciones son difíciles de aplicar, carecen de flexibilidad y carecen de sensibilidad. La falta de una técnica conveniente y sensible para analizar la oligomerización de moléculas de superficie celular ha aumentado mucho la dificultad de desarrollar nuevos métodos terapéuticos y de diagnóstico basados en tales fenómenos.

En vista de lo anterior, la disponibilidad de una técnica conveniente, sensible y económica para detectar o medir la dimerización u oligomerización de analitos de superficie celular haría avanzar a la técnica en muchos campos en los que tales mediciones se están volviendo cada vez más importantes, incluyendo la investigación de ciencias biológicas, investigación médica y diagnóstico, descubrimiento de fármacos y similares.

Sumario de la invención

La invención proporciona un método de detección de dímeros de analitos asociados a membrana en una membrana celular, comprendiendo el método las etapas de:

proporcionar un compuesto de unión específico para un primer analito asociado a membrana de un dímero, comprendiendo el dímero el primer analito asociado a membrana y un segundo analito unido a membrana, y teniendo el compuesto de unión uno o más marcadores moleculares cada uno unido al mismo mediante un enlace escindible, teniendo cada uno del uno o más marcadores moleculares una característica de separación;

proporcionar una sonda de escisión específica para el segundo analito unido a membrana, teniendo la sonda de escisión un resto que induce la escisión con una proximidad eficaz;

mezclar la sonda de escisión, el compuesto de unión y la membrana celular de modo que la sonda de escisión se une específicamente al primer analito asociado a membrana y el compuesto de unión se une específicamente al segundo analito asociado a membrana y de modo que los enlaces escindibles del compuesto de unión están dentro de la proximidad eficaz del resto que induce la escisión de manera que se liberan los marcadores moleculares; y

separar e identificar los marcadores moleculares liberados para determinar la presencia o ausencia o la cantidad de dímero en la membrana celular, en el que dicho primer analito asociado a membrana y dicho segundo analito asociado a membrana son cada uno receptores del factor de crecimiento epidérmico en dicha membrana celular.

En una realización de dicho método, dicha característica de separación de dicho uno o más marcadores moleculares es la movilidad electroforética.

En una realización preferida, dicha etapa de separación y detección incluye además separar electroforéticamente dichos marcadores moleculares liberados en un tampón de separación.

En una realización preferida adicional, dicho resto que induce la escisión de dicha sonda de escisión es un fotosensibilizador y en la que dicha sonda de escisión y dicho compuesto de unión comprenden cada uno una composición de unión a anticuerpo.

En una realización preferida adicional, dichos receptores de superficie celular se seleccionan del grupo que consiste en Her1, Her2, Her3 y Her4.

La presente invención también proporciona un método de detección de un dímero que comprende un primer tipo de receptor y un segundo tipo de receptor en una muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de

proporcionar uno o más compuestos de unión específicos para diferentes determinantes antigénicos del dímero, teniendo cada compuesto de unión uno o más marcadores moleculares cada uno unido al mismo mediante un enlace escindible, y teniendo los marcadores moleculares de diferentes compuestos de unión diferente característica de separación de modo que se forman picos diferenciados en un perfil de separación tras la separación;

proporcionar una sonda de escisión que tiene un resto que induce la escisión con una proximidad eficaz, siendo la sonda de escisión específica para un determinante antigénico del dímero diferente de los determinantes antigénicos para el uno o más compuestos de unión, con la condición de que al menos uno de dichos determinantes antigénicos está en el primer tipo de receptor y al menos uno de dichos determinantes antigénicos está en el segundo tipo de receptor;

formar una mezcla de ensayo que comprende la sonda de escisión, el uno o más compuestos de unión y la muestra biológica de modo que la sonda de escisión y el uno o más compuestos de unión se unen específicamente a sus respectivos determinantes antigénicos y los enlaces escindibles del uno o más compuestos de unión están dentro de la proximidad eficaz del resto que induce la escisión de manera que se liberan los marcadores moleculares; y

separar e identificar los marcadores moleculares liberados para determinar la presencia o ausencia o la cantidad de dímero en la muestra biológica, en el que dicho primer tipo de receptor y dicho segundo tipo de receptor son receptores del factor de crecimiento epidérmico.

En una realización de dicho método, dicha característica de separación es la movilidad electroforética y dicha etapa de separación e identificación incluye separar electroforéticamente dichos marcadores moleculares liberados para formar picos diferenciados en un electroferograma.

En una realización preferida, dicha etapa de formación incluye las etapas de incubar dicha sonda de escisión, dicho uno o más compuestos de unión y dicha muestra biológica en un tampón de unión, e intercambiar el tampón de unión por un tampón de separación antes de dicha separación de dichos marcadores moleculares liberados.

En una realización preferida adicional, dicho resto que induce la escisión es un sensibilizador y en la que dicha etapa de formación incluye inducir dicho sensibilizador para generar una especie activa que escinde dichos enlaces escindibles dentro de dicha proximidad eficaz del mismo.

En una realización incluso más preferida, dicho sensibilizador es un fotosensibilizador y en la que dicha especie activa es oxígeno en estado singlete.

En una realización preferida adicional, dicha sonda de escisión...

1. Método de detección de dímeros de analitos asociados a membrana en una membrana celular, comprendiendo el método las etapas de:

proporcionar un compuesto de unión específico para un primer analito asociado a membrana de un dímero, comprendiendo el dímero el primer analito asociado a membrana y un segundo analito unido a membrana, y teniendo el compuesto de unión uno o más marcadores moleculares cada uno unido al mismo mediante un enlace escindible, teniendo cada uno del uno o más marcadores moleculares una característica de separación;

proporcionar una sonda de escisión específica para el segundo analito unido a membrana, teniendo la sonda de escisión un resto que induce la escisión con una proximidad eficaz;

mezclar la sonda de escisión, el compuesto de unión y la membrana celular de modo que la sonda de escisión se une específicamente al primer analito asociado a membrana y el compuesto de unión se une específicamente al segundo analito asociado a membrana y de modo que los enlaces escindibles del compuesto de unión están dentro de la proximidad eficaz del resto que induce la escisión de manera que se liberan los marcadores moleculares; y

separar e identificar los marcadores moleculares liberados para determinar la presencia o ausencia o la cantidad de dímero en la membrana celular, en el que dicho primer analito asociado a membrana y dicho segundo analito asociado a membrana son cada uno receptores del factor de crecimiento epidérmico en dicha membrana celular.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha característica de separación de dicho uno o más marcadores moleculares es la movilidad electroforética.

3. Método según la reivindicación 2, en el que dicha etapa de separación y detección incluye además separar electroforéticamente dichos marcadores moleculares liberados en un tampón de separación.

4. Método según la reivindicación 2, en el que dicho resto que induce la escisión de dicha sonda de escisión es un fotosensibilizador y en el que dicha sonda de escisión y dicho compuesto de unión comprenden cada uno una composición de unión a anticuerpo.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichos receptores de superficie celular se seleccionan del grupo que consiste en Her1, Her2, Her3 y Her4.

6. Método de detección de un dímero que comprende un primer tipo de receptor y un segundo tipo de receptor en una muestra biológica, comprendiendo el método las etapas de

proporcionar uno o más compuestos de unión específicos para diferentes determinantes antigénicos del dímero, teniendo cada compuesto de unión uno o más marcadores moleculares cada uno unido al mismo mediante un enlace escindible, y teniendo los marcadores moleculares de diferentes compuestos de unión, diferente característica de separación de modo que se forman picos diferenciados en un perfil de separación tras la separación;

proporcionar una sonda de escisión que tiene un resto que induce la escisión con una proximidad eficaz, siendo la sonda de escisión específica para un determinante antigénico del dímero diferente de los determinantes antigénicos para el uno o más compuestos de unión, con la condición de que al menos uno de dichos determinantes antigénicos está en el primer tipo de receptor y al menos uno de dichos determinantes antigénicos está en el segundo tipo de receptor;

formar una mezcla de ensayo que comprende la sonda de escisión, el uno o más compuestos de unión y la muestra biológica de modo que la sonda de escisión y el uno o más compuestos de unión se unen específicamente a sus respectivos determinantes antigénicos y los enlaces escindibles del uno o más compuestos de unión están dentro de la proximidad eficaz del resto que induce la escisión de manera que se liberan los marcadores moleculares; y

separar e identificar los marcadores moleculares liberados para determinar la presencia o ausencia o la cantidad de dímero en la muestra biológica, en el que dicho primer tipo de receptor y dicho segundo tipo de receptor son receptores del factor de crecimiento epidérmico.

7. Método según la reivindicación 6, en el que dicha característica de separación es la movilidad electroforética y dicha etapa de separación e identificación incluye separar electroforéticamente dichos marcadores moleculares liberados para formar picos diferenciados en un electroferograma.

8. Método según la reivindicación 7, en el que dicha etapa de formación incluye las etapas de incubar dicha sonda de escisión, dicho uno o más compuestos de unión y dicha muestra biológica en un tampón de unión, e intercambiar el tampón de unión por un tampón de separación antes de dicha separación de dichos marcadores moleculares liberados.

9. Método según la reivindicación 7, en el que dicho resto que induce la escisión es un sensibilizador y en el que dicha etapa de formación incluye inducir dicho sensibilizador para generar una especie activa que escinde dichos enlaces escindibles dentro de dicha proximidad eficaz del mismo.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dicho sensibilizador es un fotosensibilizador y en el que dicha especie activa es oxígeno en estado singlete.

11. Método según la reivindicación 7, en el que dicha sonda de escisión y dicho uno o más compuestos de unión comprenden cada uno una composición de unión a anticuerpo.

12. Método según la reivindicación 7, en el que al menos uno de dichos determinantes antigénicos es un sitio de fosforilación de dicho primer tipo de receptor o dicho segundo tipo de receptor.

13. Método según la reivindicación 12, en el que dicho uno o más compuestos de unión son una pluralidad de compuestos de unión en el intervalo de desde 2 hasta 10.

14. Método según la reivindicación 13, en el que dicho primer tipo de receptor y dicho segundo tipo de receptor se seleccionan cada uno del grupo que consiste en Her1, Her2, Her3 y Her4.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dicho dímero es un heterodímero u homodímero que comprende tipos de receptores seleccionados del grupo que consiste en Her1, Her2, Her3 y Her4.

16. Método según la reivindicación 15, en el que dicho dímero es un homodímero Her1-Her1, un heterodímero Her1-Her2, un heterodímero Her1-Her3 o un heterodímero Her2-Her3.