CEPA DE MYCOBACTERIUM RECOMBINANTE QUE EXPRESA UNA PROTEINA FAP MICOBACTERIANA BAJO EL CONTROL DE UN PROMOTOR ACTIVO EN HIPOXIA Y SU APLICACION PARA TERAPIA DE CANCER.

Una cepa BCG de Mycobacterium bovis recombinante, caracterizada por que comprende una secuencia codificante de proteína FAP micobacteriana bajo el control transcripcional de una secuencia promotora que está activa en condiciones de hipoxia

La invención se refiere a una cepa de Mycobacterium recombinante que expresa un fragmento polinucloeotídico que codifica una proteína FAP micobacteriana bajo el control transcripcional de un promotor activo en condiciones de hipoxia y su uso para la prevención y tratamiento de tumores epiteliales.

El cáncer de vejiga está entre los cinco cánceres principales en hombres y es de tres a cuatro veces menos frecuente en mujeres. Más del 80% de estos cánceres son carcinomas celulares transicionales superficiales. La inmunoterapia intravesical con bacilo Calmette-Guerin (BCG) es, en la actualidad, la referencia para el tratamiento y profilaxis del carcinoma celular transicional superficial de la vejiga urinaria; es la terapia más eficaz para prevenir recurrencias tumorales superficiales y tratar tumores residuales de la vejiga después de una resección tumoral transuretral (Lamm et al., N. Engl. J. Med., 1991, 325, 1205-).

Mientras que el efecto antitumoral de BCG está bien establecido, el mecanismo a través del cual se produce está menos claro. Algunos estudios sugieren que la respuesta inmune mediada por células a BCG juega un papel crítico en el efecto antitumoral de BCG. Al mismo tiempo, otros estudios identifican un efecto antitumoral directo de BCG. La contribución relativa de estos dos posibles mecanismos a la actividad clínica antitumoral de BCG sigue siendo desconocida.

La instilación de BCG en la vejiga provoca una respuesta inflamatoria compleja durante la que se liberan linfocitos y diversas citoquinas a la orina. Se ha propuesto que los granulomas locales formados en el estroma suburotelial juegan un papel clave en el control de las células de carcinoma (Alexandroff et al, The Lancet, 1999, 353, 1689-1694). Se ha hipotetizado que las células NK median una parte de este control. La producción de diferentes citoquinas (IL-2, IL-12, IL-18 e interferones

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) se sobreexpresa después de terapia con BCG y puede activar las células NK (Suttmann et al., The Journal of Urology, 2004, 172, 1490-1495). Sin embargo, las respuestas inmunes intensas observadas en algunos pacientes no se correspondían con un mejor control de la enfermedad y los mecanismos inmunológicos que permiten el control de la proliferación de las células de carcinoma aun no están claros.

Varios estudios demuestran que BCG ejerce un efecto anti proliferativo directo en las células de carcinoma urotelial humano. La proteína secretada rica en alanina y prolina APA (también denominada FAP-B, antígeno MPT-32, glicoproteína de 45 kDa, o antígeno de 45/47-kDa) de la familia de la proteína de unión a fibronectina micobacteriana (FAP) es una proteína necesaria para la unión in vivo de BCG a las células epiteliales de vejiga y la mediación de actividad antitumoral inducida por BCG (Zhao et al., Int. J. Cancer, 2000, 86, 83-88). Las proteínas FAP micobacterianas constituyen una familia de proteínas altamente homologas que se unen a fibronectina de una manera específica. Las proteínas FAP de al menos cinco especies micobacterianas incluyen M. leprae (FAP-L), M. avium (FAP-A), M. bovis BCG (FAP-B; número de acceso GenBank AF013569), M. smegmatis (FAP-S) y M. tuberculosis (APA, antígeno MPT-32, glicoproteína de 45-kDa, o antígeno de 45/47-kDa; número de acceso de EMBL X80268) se han clonado y caracterizado. La región de unión a fibronectina (posiciones 269-292 de FAPA) contiene un tetrapéptido RWFV conservado (posiciones 273 a 276 de FAP-A) que es necesario para la función de unión a fibronectina. La secuencia de unión mínima es el péptido de 12 aminoácidos, 269-280 (posiciones 269 a 280 de FAP-A; Zhao et al., The Journal of Biological Chemistry, 1999, 274, 45214526). La proteína APA funciona como una opsonina, uniendo BCG a las integrinas de superficie celular, mediante un puente de fibronectina. La adherencia de BCG mediada por FAP a la integrina

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1 de la superficie de carcinoma urotelial, que es el receptor de FAP predominante en las células uroteliales, induce rutas de señalización y de transactivacion génica que implican a NF-

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B y AP-1. La detención del ciclo celular en la interfase G1/S, en lugar de la apoptosis, es el mecanismo que contribuye al efecto antiproliferativo de BCG (Chen et al., BMC Urology, 2005, 5:8).

Sin embargo, el uso de BCG para el cáncer de vejiga tiene inconvenientes, tanto en términos de eficacia como toxicidad. Primero, la respuesta a BCG es impredecible y no lineal. Como resultado, el 30% de los pacientes son refractarios a BCG y no existen factores de pronóstico fiables actualmente que predigan con precisión el éxito o el fracaso del tratamiento. Además, la durabilidad a largo plazo de la respuesta a BCG es limitada y el uso de mantenimiento (tres tratamientos semanales cada tres a seis meses) o la terapia de refuerzo (una vez al mes) hasta 36 meses es necesaria para reducir la recurrencia del cáncer de vejiga.

Segundo, BCG tiene efectos secundarios. La mayoría de los pacientes experimentan síntomas locales de cistitis incluyendo frecuencia, urgencia, disuria y ocasional hematuria. Los síntomas sistémicos leves de alta temperatura, malestar y una enfermedad de tipo gripe transitoria también son comunes. Aparecen efectos secundarios graves en el 5% de los pacientes, aproximadamente el 10% de los cuales implica sepsis franca de BCG (Alexandroff et al., citado anteriormente).

Recientes avances en la tecnología de micobacterias recombinantes han abierto nuevos horizontes para la inmunoterapia del cáncer de vejiga. Se han sugerido diversos enfoques para producir una alternativa recombinante al BCG que sea menos tóxica y/o más eficaz que la BCG existente (Alexandroff et al., citado anteriormente):

- un BCG recombinante que expresa citoquinas humanas de interés tales como interleuquina 2, interferón gamma, factor de necrosis tumoral alfa; se espera que este BCG recombinante sea más inmunopotente y pueda de esta manera conducir al uso de dosis inferiores de BCG y minimizar la posibilidad de infección por BCG sistémica, -una cepa recombinante de BCG que es menos virulenta o que incorpora un gen suicida o sensibilidades a fármaco antimicrobiano que son menos tóxicas y más eficaces que otros fármacos antituberculosis convencionales; se espera que estos BCG recombinantes produzcan menos efectos secundarios.

Además, se ha sugerido usar una cepa no patógena de micobacterias, tal como M. smegmatis.

Sin embargo, hasta la fecha, ninguno de estos enfoques ha proporcionado una alternativa a la inmunoterapia con BCG. Es en este contexto en el que se realizó la invención.

Sabiendo que la PO2 en orina es baja (Leonhardt et al., New Engl. J. Med., 1963, 269, 115-121), es decir, la PO2 local de la superficie del epitelio de la vejiga en la que crecen las células de carcinoma, los inventores han desarrollado por ingeniería genética un BCG recombinante (BCG Apa++) que sobreexpresa la proteína APA en condiciones hipóxicas. En esta construcción, la expresión del marco abierto de lectura de APA se conduce por el promotor de

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- cristalina micobacteriana. La

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- cristalina es una proteína que se sintetiza específicamente durante el crecimiento de fase exponencial tardía y estacionaria de M. tuberculosis in vitro, después de un cambio en las condiciones limitantes de oxígeno y puede jugar un papel en la supervivencia a largo plazo de M. tuberculosis in vivo (Yuan et al., J. Bacteriol., 1996, 178, 4484-4492). La administración in vivo de BCG Apa++ conduce a la sobreexpresión de la proteína APA en tejidos en los que la presión parcial de oxígeno es baja, tal como la vejiga (Leonhardt et al., N. England J. Medecine, 1963, 269, 115-121). Como resultado, BCG Apa++ es más activa que el BCG de tipo silvestre para controlar la proliferación de las células de carcinoma de vejiga humano, tanto in vitro como in vivo. Este BCG recombinante debería bajar las dosis de BCG usadas y minimizar los efectos secundarios asociados con la inmunoterapia de BCG.

Por lo tanto, la invención se refiere a un vector recombinante que comprende un fragmento polinucleotídico que codifica una proteína FAP micobacteriana bajo el control transcripcional de una secuencia promotora que está activa en condiciones de hipoxia. Definiciones

- Mediante vector se pretende una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido a una célula hospedadora.

- Mediante vector de expresión se pretende un vector capaz de dirigir la expresión de un polinucleótido...

1. Una cepa BCG de Mycobacterium bovis recombinante, caracterizada por que comprende una secuencia codificante de proteína FAP micobacteriana bajo el control transcripcional de una secuencia promotora que está activa en condiciones de hipoxia.

2. La cepa BCG recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizada por que dicha proteína FAP micobacteriana es la proteína APA de Mycobacterium tuberculosis.

3. La cepa BCG recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizada por que dicho promotor es un promotor micobacteriano.

4. La cepa BCG recombinante de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizada por que dicho promotor es el promotor HSPX.

5. La cepa BCG recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que comprende una secuencia codificante de proteína APA de Mycobacterium tuberculosis bajo el control transcripcional del promotor HSPX.

6. La cepa BCG recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que se transforma de manera estable con el plásmido pYAPA2031, depositado en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, el 21 de julio de 2006, con el número de acceso I-3659, identificada como BCG Apa++ .

7. Una composición antitumoral, caracterizada por que comprende una cantidad adecuada de la cepa BCG recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en un transportador aceptable.

8. La composición antitumoral de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada por que dicha cepa BCG recombinante es BCG recombinante viva.

9. La composición antitumoral de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizada por que dicha cepa BCG recombinante es BCG recombinante muerta.

10. La composición antitumoral de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizada por que dicha BCG recombinante muerta es BCG recombinante liofilizada de forma prolongada.

11. La composición antitumoral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizada por que comprende entre 106 y 1010 UFC o UFC equivalente de cepa BCG recombinante.

12. La composición antitumoral de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, caracterizada por que comprende un agente inmunoestimulador.

13. Un producto que contiene una cepa BCG recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un agente inmunoestimulador, como preparación combinada para su uso simultáneo, separado o secuencial en terapia antitumoral.

14. Uso de una cepa BCG recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la fabricación de un medicamento dirigido a la prevención o el tratamiento de un tumor en un sujeto.

15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado por que dicho medicamento se dirige al tratamiento de tumores epiteliales.

16. El uso de acuerdo con la reivindicación 14 o reivindicación 15, caracterizado por que dichos tumores se seleccionan del grupo que consiste en: carcinoma celular transicional de la vejiga, carcinoma pulmonar, carcinoma de cérvix y carcinoma de colon.

17. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado por que la cepa BCG recombinante es la cepa BCG Apa++ .

18. Uso de un casete de expresión que consiste en un fragmento polinucleotídico que comprende una secuencia promotora que está activa en condiciones de hipoxia, como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 4, unida operativamente a una secuencia que codifica la proteína FAP micobacteriana, como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2 o de un vector recombinante que comprende dicho fragmento polinucleotídico, para la preparación de una cepa BCG Mycobacterium bovis de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado por que dicho vector recombinante es un plásmido recombinante.

20. El uso de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado por que el casete de expresión está integrado en el genoma de dicha cepa BCG de Mycobacterium bovis recombinante.