Células madre adultas que se obtienen por cultivo de sangre derivada del cordón umbilical en un medio que contiene 5-20% de suero o plasma humano y exhiben las características de:

(a) exhibir respuestas inmunológicas positivas a la totalidad de CD24, CD29, CD31, CDE33, CD45, CD73 y CD49B, y respuestas inmunológicas negativas a CD34, CD51/61, CD62L, CD62P, CD90, CD133 y CD135;

(b) crecer, adhiriéndose a los plásticos y exhibiendo características morfológicas de forma redonda o forma de husillo; y

(c) tener la capacidad de diferenciarse en las células derivadas de mesodermo, endodermo y ectodermo

Células madre multipotentes aisladas de la sangre del cordón umbilical y el agente terapéutico celular que comprende las mismas para tratamiento de la enfermedad isquémica.

Campo técnico

La presente invención se refiere a células madre multipotentes, células madre adultas aisladas por cultivo de sangre del cordón umbilical en un medio que contiene suero o plasma humano, y un agente terapéutico celular para la necrosis isquémica resultante de enfermedad arterial oclusiva, que contiene las células madre multipotentes como ingredientes activos.

Técnica anterior

Con el envejecimiento de la sociedad, el caso de trastorno circulatorio de la sangre causado por enfermedad arterial oclusiva se ha incrementado. Enfermedades típicas de este trastorno circulatorio sanguíneo incluyen infarto de miocardio, infarto cerebral, enfermedad de Buerger, que es una enfermedad vascular periférica oclusiva en la cual los vasos sanguíneos se contraen o llegan a estrecharse debido a inflamación o cambios de la pared vascular en arterias o venas pequeñas en manos o pies, principalmente por debajo de las rodillas, de tal modo que los vasos sanguíneos llegan a obstruirse por completo, así como enfermedad arterial oclusiva causada por trastornos microvasculares o macrovasculares resultantes de complicación diabética.

El infarto de miocardio es una enfermedad en la cual una porción de arteria coronaria que suministra oxígeno y nutrientes al corazón se ocluye hasta detener la circulación sanguínea de tal manera que una pared cardiaca (es decir el miocardio) en dicha porción se degrada. Los infartos cerebrales incluyen infarto cerebral trombótico en el cual los vasos sanguíneos llegan a estrecharse o se ocluyen debido a ateroesclerosis para causar inhibición del flujo sanguíneo y carencia de oxígeno de tal manera que el tejido cerebral se destruye, e infarto cerebral embólico en el cual una pieza (émbolo) desprendida del trombo de una arteria con ateroesclerosis se engancha en la pared vascular para bloquear las arterias durante su flujo a través de los vasos sanguíneos cerebrales de tal manera que el tejido cerebral bajo la misma muere.

Se deduce que la enfermedad de Buerger es resultado de la acción compleja de diversos factores, aunque su causa directa no se ha encontrado. La edad, el sexo, factores genéticos familiares, autoinmunidad, profesiones, el hábito de fumar, y análogos se consideran como factores causantes secundarios. Asimismo, dado que los pacientes con enfermedad de Buerger tienen altos niveles de fibrinógeno en sangre, la constricción de los vasos sanguíneos periféricos resultante de la coagulación excesiva de la sangre, la agregación excesiva de las plaquetas o la excesiva sensibilidad del nervio simpático se supone que son un factor causal.

La gangrena de las extremidades, que es uno de los síntomas más terribles en la complicación diabética, ocurre en la diabetes grave y es un síntoma peligroso cuando los extremos de manos o pies se deterioran gravemente y se ennegrecen. Aunque la causa exacta no es conocida, se deduce que es resultado de síntomas, tales como heridas externas, quemaduras y purulencia. La gangrena de las extremidades es una enfermedad que ocurre frecuentemente en pacientes de más de 50 años de edad y exhibe síntomas de inflamación, ampollas, úlceras, fiebre, y análogos, y en casos severos, conduce a la amputación de manos y pies o a la muerte.

Esta enfermedad arterial oclusiva ocurre con mayor frecuencia en los Coreanos que en los hombres blancos y se admite que asciende a aproximadamente el 15% de las enfermedades arteriales periféricas totales, aunque sus datos estadísticos auténticos en Corea no son todavía suficientes (Laohapensang, K. et al., Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg., 28 (4):418, 2004). La enfermedad arterial oclusiva invade las arterias y venas pequeñas o de tamaño medio en las extremidades distales superiores e inferiores, y el estancamiento de la circulación arterial en los extremos de los miembros causa en la mayoría de los casos trastornos circulatorios periféricos que degradan el tejido del sistema microvascular, dando como resultado enfermedad isquémica. En esta necrosis isquémica, debida a la reducción de la presión del flujo de la sangre arterial y el estancamiento del flujo sanguíneo capilar, los leucocitos y las plaquetas se activan y el endotelio vascular llega a deteriorarse, dando como resultado hipoxia local y cambios metabólicos.

Las terapias para enfermedad oclusiva arterial incluyen cirugía de bypass arterial en la que se utilizan vasos sanguíneos artificiales para fabricar nuevos vasos sanguíneos entre las porciones superior e inferior de las arterias ocluidas de tal manera que la sangre pueda fluir satisfactoriamente a través de las arterias, así como terapia con fármacos consistente en la administración de vasodilatadores, y un método terapéutico de anestesia del nervio simpático del lumbar (sic) a fin de dilatar los pequeños vasos sanguíneos en los miembros. En la actualidad, se están realizando estudios para el desarrollo de un método terapéutico con el uso del factor de crecimiento endotelial vascular 165 (VEGF 165) (Kim, H.J. et al., Exp. Mol. Med., 36 (4):336, 2004) y el desarrollo de un método terapéutico para el trasplante autólogo de células hematopoyéticas (Miyamoto, M. et al., Cell Transplant., 13 (4):429, 2004).

La causa exacta de la necrosis isquémica no se ha encontrado todavía, y la enfermedad tiene una característica que continúa progresando, por lo que se encuentra en una fase en la que no se ha establecido todavía un método de tratamiento seguro. Un propósito final de tratamiento de la necrosis isquémica causada por enfermedades arteriales oclusivas, tales como la enfermedad de Buerger, es lograr que la sangre arterial fluya libremente.

Entretanto, el término células madre se refiere a células que tienen no sólo capacidad de autorreplicación sino también la capacidad de diferenciarse en al menos dos células, y pueden dividirse en células madre totipotentes, células madre pluripotentes, y células madre multipotentes.

Las células madre totipotentes son células que tienen propiedades de potencial total capaces de desarrollarse en un individuo perfecto, y estas propiedades son poseídas por células hasta la etapa de 8 células después de la fertilización de un oocito y un espermatozoide. Cuando estas células se aíslan y trasplantan en el útero, las mismas pueden desarrollarse en un individuo perfecto.

Las células madre pluripotentes, que son células capaces de desarrollarse en diversas células y tejidos derivados de las capas ectodérmica, mesodérmica y endodérmica, se derivan de una masa de células interna localizada en el interior de los blastocitos generados 4-5 días después de la fertilización. Estas células se denominan células madre embrionarias y pueden diferenciarse en diversas otras células tisulares, pero no forman nuevos organismos vivos.

Las células madre multipotentes, que son células madre capaces de diferenciarse únicamente en células específicas de tejidos y órganos que contienen estas células, están implicadas no sólo en el crecimiento y desarrollo de diversos tejidos y órganos en los periodos fetal, neonatal y adulto, sino también en el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos adultos y la función de inducir regeneración después de deterioro tisular. Las células multipotentes con especificidad tisular se denominan colectivamente células madre adultas.

Las células madre adultas derivadas de sangre del cordón umbilical conocidas hasta ahora incluyen células madre mesenquimáticas capaces de diferenciarse en osteocitos o músculos esqueléticos (Lee, O.K. et al., Blood, 103:1669, 2004; Gang, E.J. et al., BBRC, 321:102, 2004; Gang, E.J. et al., Stem Cell, 22:617, 2004), células madre del corazón capaces de diferenciarse en células cardiacas (US 2004/0126879) y células progenitoras endoteliales (Yamamoto K. et al., Arterio. Thromb. Vasc. Biol., 24: 192, 2004).

Sin embargo, dado que las células madre muestran la capacidad de diferenciarse en tejidos limitados, con inclusión de diferenciación en osteocitos o músculos esqueléticos por las células madre mesenquimáticas, diferenciación en células cardiacas por células madre del corazón, y diferenciación en células endoteliales vasculares por células progenitoras endoteliales, es difícil definir estas células como células madre multipotentes verdaderas. Asimismo, en la bibliografía citada anteriormente, se utilizó...

1. Células madre adultas que se obtienen por cultivo de sangre derivada del cordón umbilical en un medio que contiene 5-20% de suero o plasma humano y exhiben las características de:

(a) exhibir respuestas inmunológicas positivas a la totalidad de CD24, CD29, CD31, CDE33, CD45, CD73 y CD49B, y respuestas inmunológicas negativas a CD34, CD51/61, CD62L, CD62P, CD90, CD133 y CD135;

(b) crecer, adhiriéndose a los plásticos y exhibiendo características morfológicas de forma redonda o forma de husillo; y

(c) tener la capacidad de diferenciarse en las células derivadas de mesodermo, endodermo y ectodermo.

2. Las células madre adultas de acuerdo con la reivindicación 1, que exhiben adicionalmente respuestas inmunológicas positivas a SH-2 y/o SH-3.

3. Las células madre adultas de acuerdo con la reivindicación 1, que exhiben respuestas inmunológicas positivas o negativas a CD44, CD105 y CD117.

4. Las células madre adultas de acuerdo con la reivindicación 1, en las cuales las células derivadas de mesodermo son células osteogénicas, células nerviosas o células endoteliales.

5. Un método para producir células madre adultas que exhiben las características siguientes:

(a) exhibir respuestas inmunológicas positivas a la totalidad de CD24, CD29, CD31, CDE33, CD45, CD73 y CD49B, y respuestas inmunológicas negativas a CD34, CD51/61, CD62L, CD62P, CD90, CD133 y CD135;

(b) crecer, adhiriéndose a los plásticos y exhibiendo características morfológicas de forma redonda o forma de husillo; y

(c) tener la capacidad de diferenciarse en las células derivadas de mesodermo, endodermo y ectodermo,

comprendiendo el método los pasos de: cultivar sangre derivada del cordón umbilical en un medio que contiene 5-20% de suero o plasma humano; y recuperar las células madre adultas.

6. El método para producir células madre adultas de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual el suero o plasma humano es autólogo o alólogo.

7. Un agente terapéutico celular que contiene las células madre adultas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 como ingredientes activos para el tratamiento de la enfermedad necrótica isquémica o enfermedades cardiovasculares causadas por enfermedad oclusiva arterial o venosa.

8. El agente terapéutico celular de acuerdo con la reivindicación 7, en el cual la enfermedad necrótica isquémica se selecciona del grupo constituido por infarto de miocardio, infarto cerebral, necrosis avascular de la articulación de la cadera, enfermedad de Buerger, y gangrena de las extremidades resultante de complicaciones diabéticas.