BACILLUS SUBTILIS PARA USO CONTRA PATOGENOS ANIMALES Y HUMANOS.

Células bacterianas de la cepa de Bacillus subtilis obtenible del tracto gastrointestinal de un pollo caracterizadas por tener el siguiente perfil de azúcares API:

en las que un extracto de fermentación obtenible a partir de las células tiene actividad antimicrobiana contra las bacterias patógenas humanas y animales Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli y Streptococcus pneumoniae

Bacillus subtilis para uso contra patógenos animales y humanos.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere en general a compuestos antimicrobianos y, más específicamente, a compuestos antimicrobianos de Bacillus subtilis PB6 para el uso contra patógenos animales y humanos.

La enteritis necrótica, una enfermedad enterotoxémica causada por Clostridium perfringens, conduce al desarrollo de lesiones necróticas en la pared intestinal que dan como resultado la mortalidad de aves de corral (Paulus y Ruckebusch, 1996; Tsai y Tung, 1981). También es una enfermedad multifactorial con epidemiología y patogénesis complejas y parcialmente desconocidas (Kaldhusdal, 2000). La bacteria, C. perfringens, se encuentra comúnmente en el tracto gastrointestinal de aves de corral (Tshirdewahn et al., 1991), sin embargo, la aparición de enteritis necrótica es esporádica (Cowen et al., 1987). No obstante, se han implicado piensos contaminados con C. perfringens en brotes de enteritis necrótica en pollos (Kaldhusdal, 2000). Los estudios también han demostrado que los pollos sanos tienen un número relativamente reducido de C. perfringens en sus tractos gastrointestinales, aunque un aumento en la concentración de las bacterias puede dar como resultado una afección de enteritis necrótica (Craven et al., 1999).

El uso de la bacitracina, lincomicina y otros antibióticos promotores del crecimiento se usa comúnmente para tratar a aves de corral que padecen enteritis necrótica (Craven et al., 1999). Sin embargo, debido al aislamiento de cepas resistentes a antibióticos de C. perfringens de pollos y pavos (Devriese et al., 1993; Kondo, 1988; Watkins et al., 1997), las autoridades sanitarias y los productores de aves de corral están cada vez más interesados en el desarrollo y la aplicación de productos probióticos para sustituir antibióticos. Los probióticos se han definido como un complemento alimenticio microbiano vivo que afecta beneficiosamente al hospedador mejorando su equilibrio microbiano intestinal. Algunos investigadores piensan que esta normalización de la microbiota intestinal conferirá los siguientes beneficios: (a) protección frente a patógenos por exclusión competitiva (también denominada resistencia a la colonización); (b) suministro de ciertos nutrientes y reacciones enzimáticas/de detoxificación; (c) implicación en la morfogénesis tisular y la actividad peristáltica; y (d) interacción con los sistemas inmune y endocrino del hospedador.

Además, a la luz del aumento de la enteritis necrótica en aves de corral y la prohibición progresiva de diversos antibióticos para piensos por muchos países (Council of the European Communities, 1998), existe un cambio hacia promotores del crecimiento alternativos (AGP) para mejorar el rendimiento animal. Se han usado microorganismos beneficiosos tales como levaduras o bacterias ácido lácticas en producción animal durante las últimas dos décadas. Las bacterias con atributos probióticos tienen la función primaria de mantener una microflora intestinal sana por sustitución o desplazamiento de las bacterias patógenas en el tracto intestinal. Se ha sabido que los probióticos podían mantener una microflora intestinal "normal" por exclusión competitiva (Tournot, 1989) y acción antagonista contra bacterias patógenas en el intestino animal (Fuller, 1989). Generalmente, los microorganismos probióticos podían proliferar en grandes cantidades en el interior del intestino, inhibiendo de este modo la multiplicación de bacterias patógenas. Los microorganismos probióticos que tienen usos potenciales en seres humanos o animales incluyen Bacillus spp., Lactobacillus spp., Enterococcus spp. y Streptococcus spp. (Lee et al., 1999). Se ha descrito que diversos microorganismos son capaces de colonizar diferentes partes del tracto gastrointestinal (Jin et al., 1997). Generalmente, la porción del duodeno del tracto gastrointestinal tiene la menor población de microflora bacteriana en comparación con el ciego, que tiene la mayor concentración de microorganismos (Mead y Adams, 1975; Salanitro et al, 1974). Se han aislado microorganismos tales como Lactobacillus spp., Streptococcus spp. y Escherichia coli de las porciones de duodeno, yeyuno e íleon del intestino delgado (Shapiro y Sarles, 1949). La población microbiana general del ciego comprende anaerobios estrictos tales como Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Lactobacillus spp., Fusobacterium spp. y Bacteroides (Barnes et al., 1972; Mead, 1997).

Se aislaron y exploraron como probióticos potenciales contra C. perfringens bacterias beneficiosas de diversos segmentos del tracto intestinal del pollo. Estudios anteriores demostraron que la capacidad de microorganismos probióticos para adherirse y colonizar las células epiteliales del tracto gastrointestinal es en gran medida dependiente del sitio específico de los aislados de un origen animal específico (Barrow et al., 1980; Reid, 1999; Fuller, 1973; Wesney y Tannock, 1979). Existen muchos efectos beneficiosos asociados con el uso de probióticos microbianos en piensos animales. Estos efectos beneficiosos incluyen la exclusión competitiva de E. coli patógena (Watkins et al., 1982), Campylobacter jejuni (Morishita et al., 1997) y Salmonella enteritidis (Pascual et al., 1999), la potenciación del crecimiento y la viabilidad de la microflora intestinal beneficiosa (Hosoi et al., 2000) y la digestión y absorción mejoradas de nutrientes (Ratcliff, 2000; Scheinbach, 1998; Sissons, 1989; Thomke y Elwinger, 1998) en pollos.

Otros criterios usados para aislar y definir bacterias probióticas incluyen la estabilidad en bilis y ácido (Hoa et al., 2000; Huis Init Veld y Shortt, 1996), la producción de sustancias antimicrobianas (Salminen et al., 1996) y que cumplan con la seguridad o un estado generalmente reconocido como seguro (GRAS) (Donohue y Salminen, 1996; SCAN, 2000). Se demostró que un gran número de bacterias ácido lácticas, en solitario o en combinación, presentaban grados variables de actividad antimicrobiana hacia microorganismos patógenos (Harris et al., 1989; Motlagh et al., 1991). Además, son útiles cultivos viables o extractos fermentados de bacterias ácido lácticas en el tratamiento del desplazamiento de la microflora intestinal endógena, que es característico de muchos trastornos intestinales (Charteris et al., 1997, Drake et al., 1996). Dichas bacterias son capaces de sobrevivir a condiciones ácidas y biliares para colonizar el tracto intestinal, o al menos temporalmente, adherirse al epitelio. Se ha descrito que mejoran el ritmo de crecimiento y la utilización del pienso en cerdos, pollos y terneros (Hale y Newton, 1979; Tortuero, 1973; Schwab et al., 1980). Además, se ha observado una disminución significativa en la aparición de diarrea en cerdos y terneros alimentados con estas bacterias beneficiosas (Lee et al., 1999). También se piensa que los cultivos bacterianos ácido lácticos neutralizan el efecto de enterotoxinas de E. coli en cerdos (Mitchell y Kenworthy, 1976). Otros efectos beneficiosos de las bacterias ácido lácticas incluyen el desplazamiento de bacterias perjudiciales incluyendo C. perfringens, reducción de actividad ureasa bacteriana, síntesis de vitaminas, efectos estimuladores sobre el sistema inmune y contribución a la digestión (Hofacre et al., 1998). Estudios anteriores han demostrado que Lactobacillus rhamnosus (Alander et al., 1999; Asensio et al., 1976, Silva et al., 1987), L. plantarum (Andersson, 1986; West y Warner, 1988), Lactococcus lactis ssp. lactis (Motlagh et al., 1991; Spelhaug y Harlander, 1989) y Pediococcus pentosaceus (Fleming et al., 1975, Graham y McKay, 1985) eran bactericidas frente a Clostridium spp.

Comúnmente se aíslan péptidos microbianos con una actividad antimicrobiana pronunciada de animales, plantas, microbios (Sahl, 1985) y en alimentos no estériles (Muriana, 1993). Son pequeños y catiónicos, con masas moleculares de entre 3000 y 6000 Daltons (Roller, 1991). Se ha demostrado que la modificación post-traduccional de péptidos precursores introduce puentes tioéter intramoleculares en péptidos catiónicos tales como Pep 5, nisina y subtilina (Gross y Morell, 1971; Kordel y Stahl 1986; Kordel et al., 1989). Aunque estos péptidos ofrecen una ventaja de seguridad potencial importante sobre conservantes...

1. Células bacterianas de la cepa de Bacillus subtilis obtenible del tracto gastrointestinal de un pollo caracterizadas por tener el siguiente perfil de azúcares API:

en las que un extracto de fermentación obtenible a partir de las células tiene actividad antimicrobiana contra las bacterias patógenas humanas y animales Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli y Streptococcus pneumoniae.

2. Células bacterianas de acuerdo con la reivindicación 1, en las que las células tienen el perfil de ribotipado de la Figura 2.

3. Células bacterianas de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en las que las células son estables durante al menos 90 minutos tras la exposición a un pH 2.

4. Células bacterianas de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en las que las células son estables después de la exposición a pH 2 y posterior incubación a pH 6 con sales biliares al 0,75% durante al menos 90 minutos.

5. Composición que comprende células de acuerdo con la reivindicación 1 y un medio de fermentación, que se ha incubado a 37ºC y tiene actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli y Streptococcus pneumoniae.

6. Composición de acuerdo con la reivindicación 5 en la que el medio de fermentación es caldo tríptico de soja estéril que contiene un 0,6% de extracto de levadura.

7. Composición de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, que conserva un 90% de la actividad antimicrobiana contra Clostridium spp. tras la exposición a al menos 121ºC durante al menos 15 minutos.

8. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que conserva una actividad antimicrobiana contra Clostridium spp de al menos el 60% tras el tratamiento con tripsina, de al menos el 44% tras la exposición a pronasa y de al menos el 79% tras la exposición a pepsina.

9. Procedimiento para producir una composición antibacteriana que comprende